悬浮培养细胞的透化

悬浮培养物
胞外缓冲液 ATP 储存液

1. 约在实验开始前 1 小时，用 50 ml 灭菌试管以 1000 g 离心悬浮培养物 5 分钟，用 40 ml 左右胞外缓冲液清洗细胞两次。用预热至 37℃ 的胞外缓冲液重悬细胞至 10⁷ 细胞/ml。于 37℃ 轻轻摇动 15~30 分钟，让细胞达到平衡。

2. 1000 g 离心 5 分钟，吸去缓冲液。往新鲜透化缓冲液中加链球菌溶血素 O 至每毫升 0.6 单位，该溶液已先加了冷 ATP 至100 μmol/L 进行预平衡。将这透化溶液加入细胞中，轻轻地混匀。

3. 于 37℃ 温育 1~5 分钟。

4. 加 [γ-³²P] ATP 储存液至终浓度 50~500 μCi/ml。

5. 加入要研究的实验试剂，如药理试剂、多肽、Fab' 片段，放置一段时间让它们发挥作用。

6. 加入所需的受体激动剂。

7. 制备免疫沉淀样品或者 PAGE 样品。

(1) 加入等量冰冷的 2X 裂解缓冲液终止反应。往裂解缓冲液中加蛋白酶抑制剂储存液；如加 PMSF 至终浓度 1 mmol/L，加的抑胃酶肽 A、亮抑酶肽及抗蛋白酶各 5 μg/ml，以及加 DTT 至 1 mmol/L。冰浴 10 分钟。

(2) 于 4℃ 全速离心裂解液，将上清吸到新离心管中。