透化细胞和退化细胞器中蛋白质的磷酸化实验

这些试剂在后面许多地方要用到，应在进行下述实验前配好。 1. 胞外缓冲液（pH 7.2，37℃） 110 mmol/L NaCl 10 mmol/L KCI 1 mmol/L MgCl2 1.5 mmol/L CaCl2 30 mmol/L HEPES 10 mmol/L 葡萄糖 过滤灭菌，4℃ 保存可达 1 个月。 2. 胞内缓冲液（pH7.4，37℃） 25 mmol/L

1. 约在实验开始前 1 小时，将细胞培养物换上含有预热（37℃）的 20 mmol/L HEPES（pH 7.2）的培养基，继续培养。让细胞在实验前与新培养基达成平衡。 2. 将所需数量的有细胞的培养基放在一个丝网托盘上，放入 37℃ 温箱再平衡 10 分钟。细胞在这种状态下能保持稳定 1 小时左右，这取决于培养基的蒸发速度。 3. 吸去培养基，立刻用预热的胞外缓冲液冲洗。 4. 去胞外缓

1. 约在实验开始前 1 小时，用 50 ml 灭菌试管以 1000 g 离心悬浮培养物 5 分钟，用 40 ml 左右胞外缓冲液清洗细胞两次。用预热至 37℃ 的胞外缓冲液重悬细胞至 107 细胞/ml。于 37℃ 轻轻摇动 15~30 分钟，让细胞达到平衡。 2. 1000 g 离心 5 分钟，吸去缓冲液。往新鲜透化缓冲液中加链球菌溶血素 O 至每毫升 0.6 单位，该溶液已先加了冷 ATP

1. 分离细胞器。 2. 于 4℃ 用胞内缓冲液清洗细胞器样品 3 次，将相当于 1 mg 蛋白质的样品转至带螺帽的小离心管，放入冰盒。 3. 离心，吸去上清，加 200 μl 预热至 37℃ 的透化缓冲液，轻轻混匀，放入 37℃ 水浴箱 。 4. 加链球菌溶血素 O 储存液至终浓度 60 单位/ml，加冷 ATP 储存液至 100 μmol/L。 5. 加 [γ-32P] ATP 至终浓

1. 准备反应混合物：反应体积通常是 50~100 ml。 5X 激酶分析缓冲液 10 μl [γ-32P] ATP（终浓度 5 μCi/5μmol/L) 5 μl 水 0~35 μl 细胞器样品（相当于 1 mg 蛋白质） 1~35 μl 2. 加入激酶，开始反应。 3. 加入 10 ml 冰冷的 5X SDS-PAGE 加样缓冲液终