原理
石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称 H.E. 对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过 HE 染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。
材料与仪器
中性福尔马林固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、苏木精染液 1%伊红酒精溶液 1%盐酸酒精溶液 甘油蛋白粘片剂 中性树胶。 卡诺固定液 埃利希苏木精染液 1%伊红酒精溶液 1%盐酸乙醇液 各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%） 二甲苯 甘油蛋白粘片剂
切片刀 切片机 恒温箱 蜡杯 酒精灯 解剖刀 解剖剪 解剖盘 培养皿 镊子 单面刀片 毛笔 包埋盒 染色缸 盖玻片 载玻片 玻片盘 树胶 树胶瓶 显微镜 温度计 脸盆 水浴锅 温台 剪刀 解剖针 小台木 染色缸 烧杯 水盆 熔蜡炉
步骤
一、试剂配法
1．中性甲醛固定液：
甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度） 100mL
磷酸氢二钠 6.5
磷酸二氢钾（钠） 4g
双蒸水 900mL
2．苏木精、伊红染色液为碧云天产品
3．1%盐酸乙醇液
盐酸 1份
70%酒精 100份
4．甘油蛋白贴片剂：
蛋白 50 ml
甘油 50 ml
水杨酸钠（防腐剂） 1g
配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫，然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂（水杨酸钠）作防腐用。可保存几个月。
二、实验步骤
1．取材
颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。
切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。
注意事项：
（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2．固定
将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30－50min。
注意事项：
（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。
（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
3. 洗涤
材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。
4. 脱水
材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。各
注意事项：
（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。
（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
（3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。
（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象
5．透明
纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明为止）。
由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
透明注意事项
（1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。
（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。
（3）在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。
6．透蜡
放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟。
透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55-60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5h。
透蜡注意事项
（1）尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；
（2）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；
（3）操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。
7. 包埋
包埋时，用镊子夹取石蜡模子（金属质地）在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。
8. 切片
（1）将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。
（2）将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。
（3）摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。
（4）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。
（5）调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10微米。
（6）一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min。
（7）切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。
（8）用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。
（9）切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。
9. 展片、贴片
打开水浴锅，使水温维持在40-45℃，另准备30%乙醇溶液。
（1） 切片时，将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。
（2） 用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在乙醇溶液的水面上，使切片展开。
（3）小镊子轻轻地将连在一起的切片分开，用一个载玻片将切片完整，已展开的切片捞至温水中，使之充分展开。
（4） 另取洁净的载玻片，捞起展开的切片，使其位于切片1/3处，另一端（磨边，粗糙的一端）磨面上标记或贴上标签，放于切片架上。
10. 脱蜡复水
将水浴锅温度调至60℃，待水温控制在60℃时，将切片连同切片架放入一干燥的染色缸内，放入水浴锅中，盖上盖子（可密封），30min至蜡熔化。
之后，石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3min。
11． 染色
切片放入苏木精中染色约10-30min。
染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。
12．水洗
用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝（或放入碱性水中也可），但要注意流水不能过大，以防切片脱落。
13．分化
将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色，约2秒至数十秒钟。见切片变红，颜色较浅即可。
14．漂洗
切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。
15．脱水Ⅰ
切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。
16、复染
用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。
伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。
17．脱水Ⅱ
将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。
18．透明
切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。
二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。
19．封藏：中性树胶封存
因切片经二甲苯透明，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。
封藏的方法：
封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。材料透明后，在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。
染色结果：细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。
注意事项
1、苏木精染色后，分色是至关重要的，应该在显微镜下进行。一般以细胞核染色比较清晰，细胞质等基本无色为宜。如发现过染，可以延长分色时间，若染色太浅，则应重新进行染色后再分色。
2、如发现伊红染色过深，可延长在95%酒精分色时间。
3、切片经酒精脱水后，如在转入二甲苯时有混浊现象产生或呈白色不透明状态，说明脱水不彻底，应立即将切片退回无水酒精重新脱水，如仍出现浑浊现象时则应更换无水酒精。
4、染色各步骤所需的时间，常受温度、切片厚度等影响，可根据镜下观察所见予以调整。
5、染色反应不正常，应检查染液及试剂是否失效或误用。
常见问题
石蜡切片可能产生的问题和解决方法
缺点一：石蜡带弯曲不直
原 因：
1.石蜡块上下两边不平行
2.石蜡块的上下两边不和刀口平行
3.刀口锋利不一，局部产生差异
4.蜡块的一边较另一边为软，或两边的硬度不一致
5.材料未居蜡块正中央
6.材料大而形不正
补救办法：
1.取下台木，将两边修干
2.调节标本台，使两者平行
3.移动刀片，改用新的刀口
4.待蜡块冷却后再切，或重新包埋
5.用刀片切去部分石蜡，使材料居中
6.在大的一边切去少许石蜡
缺点二：切片分离、不能连成带状
原因：
1.室温过低
2.石蜡过硬
3.材料边缘留蜡太少
4.刀的角度不适合
补救办法 ：
1.在切片机上方开一电灯或提高室温
2.在蜡块面加一层45℃的软蜡或用手指蜡摩擦块面
3.重新包埋
4.矫正刀的角度
缺点三：切片卷起呈圆筒状
原因：
1.室温过低
2.石蜡过硬
3.刀口太钝
4.刀的倾角太大
补救办法 ：
1.提高室温
2.加软蜡
3用毛笔将蜡片摊开压住，切2—3 片即成带
4.减小倾角
缺点四：切片粘附于切片刀，皱摺在一起
原因：
1.室温过高
2.石蜡过软
3.刀口上留有一层石蜡
4.刀口钝
补救办法 ：
1.降低室温
2.将蜡块投入凉水中稍浸耒—增加
3.切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去刀口的石蜡
4.磨刀或移动刀口
缺点五：切片纵裂
原因：
1.刀有缺口
2.石蜡块中含有颗粒、杂质
3.刀口留有碎屑或细丝
4.组织太硬
补救办法 ：
1.可移动刀口
2.将颗粒拽去
3.清洁刀口
4.让包埋块在水中浸泡
缺点六：切片有横纹
原因：
1.刀和台木的固定螺丝太松
2.刀口倾斜度太大
3.刀口有石蜡屑
补 救 办 法 ：
1.旋紧螺旋
2.可放平1—2。后再切
3.用氯仿拭去
缺点七：切片厚薄不匀
原因：
1.切片机有毛病
2.夹刀不当
3.未旋紧标本台螺旋
4.石蜡块过硬
补救办法 ：
1.矫正切片机装置
2.对症治疗
3.旋紧螺旋
4.将石蜡块在水中浸泡
缺点八：每张切片厚薄不匀
原因：
1.刀口震动，是由于材料过硬
2.刀的倾角太大
补救办法 ：
1.在蜡块表面涂一层火棉胶
2.减小倾角
缺点九：材料发生裂隙破碎或脱落
原因：
1.脱水不干净
2.有透明剂残留
3.石蜡透入时，温度过高或时间过长
4.由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬发脆
5.材料太硬或太粗
补 救 办 法 ：
1.无法弥补
2.增加浸蜡时间，重新包埋
3.无法补救
4.用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明
5.在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液
缺点十：切片时发生沙沙声
原因：
1.组织块过硬
2.包埋温度过高
3.材料内留有结晶体
补救办法 ：
1.浸泡水中软化
2.无法补救
3.无法补救
缺点十一：石蜡块将蜡带抬起
原因：
1.由于摩擦而产生静电荷所致
2.石蜡块上面附有石蜡碎屑
3.刀口上附有石蜡碎屑
补救办法 ：
1.提高室温
2.用刀片将碎屑清除
3.用二甲苯或氧仿清除
来源：《神经生物学实用实验技术》
来源：丁香实验
