石蜡切片制作(苏木精-伊红对染法)

石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称 H.E. 对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过 HE 染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。

一、试剂配法

1．中性甲醛固定液：

甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度） 100mL
磷酸氢二钠 6.5
磷酸二氢钾（钠） 4g
双蒸水 900mL

2．苏木精、伊红染色液为碧云天产品

3．1%盐酸乙醇液

盐酸 1份
70%酒精 100份

4．甘油蛋白贴片剂：

蛋白 50 ml
甘油 50 ml
水杨酸钠（防腐剂） 1g
配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫，然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂（水杨酸钠）作防腐用。可保存几个月。

二、实验步骤

1．取材

颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。

切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。

注意事项：

（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。

2．固定

将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30－50min。

注意事项：

（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。

（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。

（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。

（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

3. 洗涤

材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。

4. 脱水

材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。各

注意事项：

（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。

（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。

（3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。

（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。

（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。

（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象

5．透明

纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明为止）。

由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。

透明注意事项

（1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。

（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。

（3）在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。

6．透蜡

放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟。

透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55-60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5h。

透蜡注意事项

（1）尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；

（2）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；

（3）操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。

7. 包埋

包埋时，用镊子夹取石蜡模子（金属质地）在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。

8. 切片

（1）将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。

（2）将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。

（3）摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。

（4）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。

（5）调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10微米。

（6）一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min。

（7）切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。

（8）用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。

（9）切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。

9. 展片、贴片

打开水浴锅，使水温维持在40-45℃，另准备30%乙醇溶液。

（1） 切片时，将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。

（2） 用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在乙醇溶液的水面上，使切片展开。

（3）小镊子轻轻地将连在一起的切片分开，用一个载玻片将切片完整，已展开的切片捞至温水中，使之充分展开。

（4） 另取洁净的载玻片，捞起展开的切片，使其位于切片1/3处，另一端（磨边，粗糙的一端）磨面上标记或贴上标签，放于切片架上。

10. 脱蜡复水

将水浴锅温度调至60℃，待水温控制在60℃时，将切片连同切片架放入一干燥的染色缸内，放入水浴锅中，盖上盖子（可密封），30min至蜡熔化。

之后，石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3min。

11． 染色

切片放入苏木精中染色约10-30min。

染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

12．水洗

用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝（或放入碱性水中也可），但要注意流水不能过大，以防切片脱落。

13．分化

将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色，约2秒至数十秒钟。见切片变红，颜色较浅即可。

14．漂洗

切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。

15．脱水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。

16、复染

用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。

伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。

17．脱水Ⅱ

将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。

18．透明

切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。

二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。

19．封藏：中性树胶封存

因切片经二甲苯透明，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。

封藏的方法：

封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。材料透明后，在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。

染色结果：细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。

1、苏木精染色后，分色是至关重要的，应该在显微镜下进行。一般以细胞核染色比较清晰，细胞质等基本无色为宜。如发现过染，可以延长分色时间，若染色太浅，则应重新进行染色后再分色。

2、如发现伊红染色过深，可延长在95%酒精分色时间。

3、切片经酒精脱水后，如在转入二甲苯时有混浊现象产生或呈白色不透明状态，说明脱水不彻底，应立即将切片退回无水酒精重新脱水，如仍出现浑浊现象时则应更换无水酒精。

4、染色各步骤所需的时间，常受温度、切片厚度等影响，可根据镜下观察所见予以调整。

5、染色反应不正常，应检查染液及试剂是否失效或误用。

石蜡切片可能产生的问题和解决方法

缺点一：石蜡带弯曲不直

原 因：

1.石蜡块上下两边不平行

2.石蜡块的上下两边不和刀口平行

3.刀口锋利不一，局部产生差异

4.蜡块的一边较另一边为软，或两边的硬度不一致

5.材料未居蜡块正中央

6.材料大而形不正

补救办法：

1.取下台木，将两边修干

2.调节标本台，使两者平行

3.移动刀片，改用新的刀口

4.待蜡块冷却后再切，或重新包埋

5.用刀片切去部分石蜡，使材料居中

6.在大的一边切去少许石蜡

缺点二：切片分离、不能连成带状

原因：

1.室温过低

2.石蜡过硬

3.材料边缘留蜡太少

4.刀的角度不适合

补救办法 ：

1.在切片机上方开一电灯或提高室温

2.在蜡块面加一层45℃的软蜡或用手指蜡摩擦块面

3.重新包埋

4.矫正刀的角度

缺点三：切片卷起呈圆筒状

原因：

1.室温过低

2.石蜡过硬

3.刀口太钝

4.刀的倾角太大

补救办法 ：

1.提高室温

2.加软蜡

3用毛笔将蜡片摊开压住，切2—3 片即成带

4.减小倾角

缺点四：切片粘附于切片刀，皱摺在一起

原因：

1.室温过高

2.石蜡过软

3.刀口上留有一层石蜡

4.刀口钝

补救办法 ：

1.降低室温

2.将蜡块投入凉水中稍浸耒—增加

3.切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去刀口的石蜡

4.磨刀或移动刀口

缺点五：切片纵裂

原因：

1.刀有缺口

2.石蜡块中含有颗粒、杂质

3.刀口留有碎屑或细丝

4.组织太硬

补救办法 ：

1.可移动刀口

2.将颗粒拽去

3.清洁刀口

4.让包埋块在水中浸泡

缺点六：切片有横纹

原因：

1.刀和台木的固定螺丝太松

2.刀口倾斜度太大

3.刀口有石蜡屑

补 救 办 法 ：

1.旋紧螺旋

2.可放平1—2。后再切

3.用氯仿拭去

缺点七：切片厚薄不匀

原因：

1.切片机有毛病

2.夹刀不当

3.未旋紧标本台螺旋

4.石蜡块过硬

补救办法 ：

1.矫正切片机装置

2.对症治疗

3.旋紧螺旋

4.将石蜡块在水中浸泡

缺点八：每张切片厚薄不匀

原因：

1.刀口震动，是由于材料过硬

2.刀的倾角太大

补救办法 ：

1.在蜡块表面涂一层火棉胶

2.减小倾角

缺点九：材料发生裂隙破碎或脱落

原因：

1.脱水不干净

2.有透明剂残留

3.石蜡透入时，温度过高或时间过长

4.由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬发脆

5.材料太硬或太粗

补 救 办 法 ：

1.无法弥补

2.增加浸蜡时间，重新包埋

3.无法补救

4.用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明

5.在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液

缺点十：切片时发生沙沙声

原因：

1.组织块过硬

2.包埋温度过高

3.材料内留有结晶体

补救办法 ：

1.浸泡水中软化

2.无法补救

3.无法补救

缺点十一：石蜡块将蜡带抬起

原因：

1.由于摩擦而产生静电荷所致

2.石蜡块上面附有石蜡碎屑

3.刀口上附有石蜡碎屑

补救办法 ：

1.提高室温

2.用刀片将碎屑清除

3.用二甲苯或氧仿清除