检测
最新修订时间：
原理
在 SDS 电泳中，由于 SDS 和还原试剂使蛋白质变性而失去生物活性，所以电泳后的检测方法不如常规聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳多，一般为考马斯亮蓝染色和银染色，其次为荧光方法和转移后检测。
材料与仪器
丙烯酰胺单体贮液 磷酸缓冲液贮液 咪唑缓冲液贮液 过硫酸铵 浓缩胶缓冲液贮液 分离胶缓冲液贮液 SDS TEMED
步骤
一、考马斯亮蓝染色
考马斯亮蓝染色的原理和方法请参见 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳”，由于 SDS 和蛋白质分子竞争染料而干扰考马斯亮蓝染色，所以 SDS 电泳后凝胶的固定和染色时间应比常规聚丙烯酰胺凝胶的长 1 倍左右或用多倍体积的染色液染色，以排除 SDS 的影响。
除了在 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳” 中所述的一些常规考马斯亮蓝染色方法以外，近年还有一些新的方法可供选用。作者使用的方法操作快而简便，并且可以得到非常清晰的背景。
Neuhoff 等介绍了一种高灵敏度的染色方法（30 ng/带)，无背景色，但需要过夜。
染色液：在 980 ml 2% 磷酸中加 100 g 过硫酸铵，直到完全溶解。再加 1 g 考马斯亮蓝 G-250 ( 溶在 20 ml 水中)，不需过滤，使用前振摇。
固定：将凝胶放在 12% 三氯醋酸中固定 1 小时。
染色：取 160 ml 上述染色液，在染色时加 40 ml 甲醇。凝胶染色放置过夜。
染色后用 0.1 mol/L Tris-磷酸缓冲液（pH 6.5) 漂洗 1 至 3 分钟。再用 25% （V/V) 乙醇淋洗不超过 1 min。然后在 20% 硫酸铵中稳定蛋白-染料复合物。
Barnes 等的快速染色方法是将凝胶放在 0.02% 考马斯亮蓝 R-350 ( 溶于 10% 醋酸）中，在 50℃ 加热 15 分钟。然后用 10% 醋酸在室温脱色 2 小时便可。
另一种快速的染色方法是将凝胶固定 10~15 分钟（固定液：25% 异丙醇，10% 醋酸 )，染色 2 小时（0.06% 考马斯亮蓝 G-250，10% 醋酸 ) 。如果加热染色，便可缩短时间。
Lundy 等介绍一种新的染色方法用来观察一些细胞培养液的上清液中的蛋白水解活性。将 SDS 电泳后的凝胶用含有甲醇的缓冲液漂洗，以除去 SDS。在 0.5% 酪蛋白溶液中保温，再用考马斯亮蓝 R-250 染色。具有蛋白水解活性的带非常清晰，背景为蓝色。在同一块凝胶中的分子质量蛋白标准的染色带更深。用此方法可以测定蛋白水解物的亚基分子质量。这种方法只要作稍微的修改也可以用于检测常规聚丙烯酰胺凝胶和等电聚焦电泳后的蛋白水解活性。
Sreeramulu 和 Singh 报道在考马斯亮蓝 R-250 染色后可用 0.5 mol/L NaCl 水溶液在 25℃ 脱色只需 2~3 小时（NaCl 的浓度应在 0.1~2 mol/L 范围内 )。这种方法的优点是不需要有机溶剂，而且用 NaCl 脱色的结果可得到深紫蓝色蛋白带，可提高定量测定的灵敏度，而用甲醇-醋酸脱色只能得到灰蓝色的蛋白带。
二、银染色
银染色的机制、种类和方法请参见 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳”，作者根据 Heukeshoven 等的方法改进的染色程序在国内很多实验室都得到了满意的结果，见表 5.10。关键是必须使用去离子双蒸水，甲醛和戊二醛必须是新鲜试剂，无聚合，其余试剂也应该用分析纯。染色在日光下进行，并不断振摇。
银染色的第一步是固定。固定有两个目的：一是将蛋白固定在凝胶中或至少是防止蛋白在凝胶中扩散。第二个目的是去除干扰染色的物质，如去污剂，还原试剂和缓冲液的一些组分，如甘氨酸。固定液可以是甲醛、乙醇（甲醇）和醋酸或三氯醋酸。固定后的凝胶才能由银颗粒显色。对 SDS 电泳的凝胶进行银染色，一定要在染色前除去 SDS，所以常经几次漂洗的程序。Kirkeby 等提出应该用缩短固定时间来加速银染色的程序。最佳的固定应该是时间短，不会在染色时产生背景，能有效地固定蛋白，不影响蛋白与染色剂的反应，并且固定液的浓度应尽可能的低。他们用乙醇、醛和酸溶液预固定 10 分钟，然后用极低浓度的甲醛和戊二醛的乙醇溶液或甲醛（或戊二醛）的苦味酸和乙醇溶液仅仅固定 5 分钟，便可加速灵敏的银染程序。
多肽的银染由于分子小很难被固定，文献报道认为较好的固定剂是 12.5% 戊二醛。
Swain 和 Ross 介绍了一种简单、灵敏、高分辨、低背景的银染方法见表 5.11。
组蛋白在 SDS 电泳后的银染色可采用甲醛和乙醇固定，但需要用 2,7-萘二硫酸钠（2,7-naphthaIenedi sulfonic acid-Na2) 敏化和铵银染色、组蛋白的银染色是比较困难的，酸性蛋白的银染也同样困难。
Granzier 等对分子质量在 0.7~3 MDa 之间的巨型蛋白分子的可溶性和 SDS 电泳后的银染色进行了研究。Blum 等对植物叶蛋白和病毒蛋白的银染色方法进行了改进。
三、其他染色方法
在用 Stains all 染色时，为了克服 SDS 的干扰，可以将凝胶放在 25% 异丙醇中，在 50℃ 加热 15 min。
Remazol Brimam Blue R 可用于电泳前的蛋白染色。这种预染色方法在没有 SDS 时会降低蛋白质的溶解性，所以适合于 SDS 电泳。用这种染料预染血清，蛋白不会产生沉淀，且方法灵敏，可对蛋白进行半定量测定，但蛋白谱带会有变化。
在酸性条件下，在有钼酸盐时，苯三酚红蛋白（pyrogallol red protein) 检测是基于形成一个蓝色蛋白染料复合物（pyrogallol red-molybdate PRM )。将 PRM 复合物离心，在 SDS 电泳前重新溶解。与三氯醋酸沉淀方法相比，此方法给出较均一和较好的回收率。可用于测定蛋白质和多肽的分子质量和痕量成分的检测，Marshall 介绍的此方法比较简单而经济。
Vargic 等用 α-萘吡喃葡萄糖苷（α-naphthyl glucopyranoside) 作底物，酶反应得到的 α-萘酚用快红B (fast red B) 或快蓝BB (fast blue BB) 染色，快速而简单地检测了电泳后的外-β-1，3-葡聚糖酶。
Bath 在 SDS 电泳后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并用亚金染料（Auro Dye) 进行金染色，可以除去常见的纹理现象。
四、荧光探针法
荧光标记法请参阅 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳”。
糖蛋白在 SDS 电泳后也可用 PAS 试剂（periodicacidschiff ) 检测。但 arpemer 等对 SDS 电泳分离后，用 PAS 反应不能检测的人唾液中的糖蛋白， 将其转移到硝酸纤维素膜上，用外源凝集素探针（lectin probes), 再用异硫氰酸盐（isothiocyanate) 的荧光检测。Beeley 等比较了三种方法：考马斯亮蓝 R- 250，银染和荧光方法对人唾液中蛋白的检测。结果表示不论在分辨率和灵敏度方面，丹磺酰化--转移荧光的方法都给出最好的结果，特别是当蛋白中含有较多富碱性脯氨酸时。
Vesterberg 报道了用化学发光的方法检测非还原 SDS 琼脂糖电泳后的蛋白可以大大简化操作和提高灵敏度。
五、电泳转移
电泳转移请参阅 “蛋白质印迹”。
六、电泳后蛋白带的氨基酸组成和序列分析
电泳后蛋白带的氨基酸组成的分析方法请参阅 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳”。
电泳分离后蛋白质的 N 端氨基酸序列分析能通过与异硫氰酸苯酯 (phenylisothiocyanate, PITC ) 反应，顺序地除去 N 端氨基酸来测定，即 Edman 降解法。以后比较重要的改进是采用自动固相测序。蛋白质从凝胶中电洗脱后，共价结合到活化的玻璃支持物中或吸附在合成膜上，然后用 HPLC 来鉴别氨基酸衍生物，检测灵敏度可低至 1 pmol 以下。从电泳中分离微克量的蛋白便可用于序列分析。
七、电泳后的肽图分析
SDS 电泳后的多肽能用肽图来定性。在用胰蛋白酶消化以前先用放射性标记从凝胶中洗脱的蛋白可以提高灵敏度。Elder 等介绍一种比较简单的方法，即用 SDS 电泳分离的多肽在凝胶上用放射性碘标记和用胰蛋白酶水解，肽片从凝胶上洗脱，再用双向层析和放射自显影分析。用这种方法分析的限制是蛋白质中必须含有对放射性碘化作用敏感的氨基酸残基。leveland 等的快速方法是不进行洗脱，而在电泳后的凝胶上进行部分蛋白水解裂解，然后再进行第二向的，只根据分子大小分离的 SDS 电泳。原则上，在专一位置用裂解产生多肽的方法，例如用酸水解 Asp-Pro 键，用羟胺裂解 Asn-Gly 键，用 N-氯琥珀酰胺（N-chlorosucdnamide) 裂解色氨酸残基，用溴化氰裂解甲硫氨酸残基等都能用于肽图分析。很重要的一点是要避免产生大量非常小的多肽，因为它们难以分析，而且很可能从凝胶中丢失。肽图分析的双向电泳方法请参见 “双向电泳”。
考马斯亮蓝染色的原理和方法请参见 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳”，由于 SDS 和蛋白质分子竞争染料而干扰考马斯亮蓝染色，所以 SDS 电泳后凝胶的固定和染色时间应比常规聚丙烯酰胺凝胶的长 1 倍左右或用多倍体积的染色液染色，以排除 SDS 的影响。
除了在 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳” 中所述的一些常规考马斯亮蓝染色方法以外，近年还有一些新的方法可供选用。作者使用的方法操作快而简便，并且可以得到非常清晰的背景。
Neuhoff 等介绍了一种高灵敏度的染色方法（30 ng/带)，无背景色，但需要过夜。
染色液：在 980 ml 2% 磷酸中加 100 g 过硫酸铵，直到完全溶解。再加 1 g 考马斯亮蓝 G-250 ( 溶在 20 ml 水中)，不需过滤，使用前振摇。
固定：将凝胶放在 12% 三氯醋酸中固定 1 小时。
染色：取 160 ml 上述染色液，在染色时加 40 ml 甲醇。凝胶染色放置过夜。
染色后用 0.1 mol/L Tris-磷酸缓冲液（pH 6.5) 漂洗 1 至 3 分钟。再用 25% （V/V) 乙醇淋洗不超过 1 min。然后在 20% 硫酸铵中稳定蛋白-染料复合物。
Barnes 等的快速染色方法是将凝胶放在 0.02% 考马斯亮蓝 R-350 ( 溶于 10% 醋酸）中，在 50℃ 加热 15 分钟。然后用 10% 醋酸在室温脱色 2 小时便可。
另一种快速的染色方法是将凝胶固定 10~15 分钟（固定液：25% 异丙醇，10% 醋酸 )，染色 2 小时（0.06% 考马斯亮蓝 G-250，10% 醋酸 ) 。如果加热染色，便可缩短时间。
Lundy 等介绍一种新的染色方法用来观察一些细胞培养液的上清液中的蛋白水解活性。将 SDS 电泳后的凝胶用含有甲醇的缓冲液漂洗，以除去 SDS。在 0.5% 酪蛋白溶液中保温，再用考马斯亮蓝 R-250 染色。具有蛋白水解活性的带非常清晰，背景为蓝色。在同一块凝胶中的分子质量蛋白标准的染色带更深。用此方法可以测定蛋白水解物的亚基分子质量。这种方法只要作稍微的修改也可以用于检测常规聚丙烯酰胺凝胶和等电聚焦电泳后的蛋白水解活性。
Sreeramulu 和 Singh 报道在考马斯亮蓝 R-250 染色后可用 0.5 mol/L NaCl 水溶液在 25℃ 脱色只需 2~3 小时（NaCl 的浓度应在 0.1~2 mol/L 范围内 )。这种方法的优点是不需要有机溶剂，而且用 NaCl 脱色的结果可得到深紫蓝色蛋白带，可提高定量测定的灵敏度，而用甲醇-醋酸脱色只能得到灰蓝色的蛋白带。
二、银染色
银染色的机制、种类和方法请参见 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳”，作者根据 Heukeshoven 等的方法改进的染色程序在国内很多实验室都得到了满意的结果，见表 5.10。关键是必须使用去离子双蒸水，甲醛和戊二醛必须是新鲜试剂，无聚合，其余试剂也应该用分析纯。染色在日光下进行，并不断振摇。
银染色的第一步是固定。固定有两个目的：一是将蛋白固定在凝胶中或至少是防止蛋白在凝胶中扩散。第二个目的是去除干扰染色的物质，如去污剂，还原试剂和缓冲液的一些组分，如甘氨酸。固定液可以是甲醛、乙醇（甲醇）和醋酸或三氯醋酸。固定后的凝胶才能由银颗粒显色。对 SDS 电泳的凝胶进行银染色，一定要在染色前除去 SDS，所以常经几次漂洗的程序。Kirkeby 等提出应该用缩短固定时间来加速银染色的程序。最佳的固定应该是时间短，不会在染色时产生背景，能有效地固定蛋白，不影响蛋白与染色剂的反应，并且固定液的浓度应尽可能的低。他们用乙醇、醛和酸溶液预固定 10 分钟，然后用极低浓度的甲醛和戊二醛的乙醇溶液或甲醛（或戊二醛）的苦味酸和乙醇溶液仅仅固定 5 分钟，便可加速灵敏的银染程序。
多肽的银染由于分子小很难被固定，文献报道认为较好的固定剂是 12.5% 戊二醛。
Swain 和 Ross 介绍了一种简单、灵敏、高分辨、低背景的银染方法见表 5.11。
组蛋白在 SDS 电泳后的银染色可采用甲醛和乙醇固定，但需要用 2,7-萘二硫酸钠（2,7-naphthaIenedi sulfonic acid-Na2) 敏化和铵银染色、组蛋白的银染色是比较困难的，酸性蛋白的银染也同样困难。
Granzier 等对分子质量在 0.7~3 MDa 之间的巨型蛋白分子的可溶性和 SDS 电泳后的银染色进行了研究。Blum 等对植物叶蛋白和病毒蛋白的银染色方法进行了改进。
三、其他染色方法
在用 Stains all 染色时，为了克服 SDS 的干扰，可以将凝胶放在 25% 异丙醇中，在 50℃ 加热 15 min。
Remazol Brimam Blue R 可用于电泳前的蛋白染色。这种预染色方法在没有 SDS 时会降低蛋白质的溶解性，所以适合于 SDS 电泳。用这种染料预染血清，蛋白不会产生沉淀，且方法灵敏，可对蛋白进行半定量测定，但蛋白谱带会有变化。
在酸性条件下，在有钼酸盐时，苯三酚红蛋白（pyrogallol red protein) 检测是基于形成一个蓝色蛋白染料复合物（pyrogallol red-molybdate PRM )。将 PRM 复合物离心，在 SDS 电泳前重新溶解。与三氯醋酸沉淀方法相比，此方法给出较均一和较好的回收率。可用于测定蛋白质和多肽的分子质量和痕量成分的检测，Marshall 介绍的此方法比较简单而经济。
Vargic 等用 α-萘吡喃葡萄糖苷（α-naphthyl glucopyranoside) 作底物，酶反应得到的 α-萘酚用快红B (fast red B) 或快蓝BB (fast blue BB) 染色，快速而简单地检测了电泳后的外-β-1，3-葡聚糖酶。
Bath 在 SDS 电泳后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并用亚金染料（Auro Dye) 进行金染色，可以除去常见的纹理现象。
四、荧光探针法
荧光标记法请参阅 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳”。
糖蛋白在 SDS 电泳后也可用 PAS 试剂（periodicacidschiff ) 检测。但 arpemer 等对 SDS 电泳分离后，用 PAS 反应不能检测的人唾液中的糖蛋白， 将其转移到硝酸纤维素膜上，用外源凝集素探针（lectin probes), 再用异硫氰酸盐（isothiocyanate) 的荧光检测。Beeley 等比较了三种方法：考马斯亮蓝 R- 250，银染和荧光方法对人唾液中蛋白的检测。结果表示不论在分辨率和灵敏度方面，丹磺酰化--转移荧光的方法都给出最好的结果，特别是当蛋白中含有较多富碱性脯氨酸时。
Vesterberg 报道了用化学发光的方法检测非还原 SDS 琼脂糖电泳后的蛋白可以大大简化操作和提高灵敏度。
五、电泳转移
电泳转移请参阅 “蛋白质印迹”。
六、电泳后蛋白带的氨基酸组成和序列分析
电泳后蛋白带的氨基酸组成的分析方法请参阅 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳”。
电泳分离后蛋白质的 N 端氨基酸序列分析能通过与异硫氰酸苯酯 (phenylisothiocyanate, PITC ) 反应，顺序地除去 N 端氨基酸来测定，即 Edman 降解法。以后比较重要的改进是采用自动固相测序。蛋白质从凝胶中电洗脱后，共价结合到活化的玻璃支持物中或吸附在合成膜上，然后用 HPLC 来鉴别氨基酸衍生物，检测灵敏度可低至 1 pmol 以下。从电泳中分离微克量的蛋白便可用于序列分析。
七、电泳后的肽图分析
SDS 电泳后的多肽能用肽图来定性。在用胰蛋白酶消化以前先用放射性标记从凝胶中洗脱的蛋白可以提高灵敏度。Elder 等介绍一种比较简单的方法，即用 SDS 电泳分离的多肽在凝胶上用放射性碘标记和用胰蛋白酶水解，肽片从凝胶上洗脱，再用双向层析和放射自显影分析。用这种方法分析的限制是蛋白质中必须含有对放射性碘化作用敏感的氨基酸残基。leveland 等的快速方法是不进行洗脱，而在电泳后的凝胶上进行部分蛋白水解裂解，然后再进行第二向的，只根据分子大小分离的 SDS 电泳。原则上，在专一位置用裂解产生多肽的方法，例如用酸水解 Asp-Pro 键，用羟胺裂解 Asn-Gly 键，用 N-氯琥珀酰胺（N-chlorosucdnamide) 裂解色氨酸残基，用溴化氰裂解甲硫氨酸残基等都能用于肽图分析。很重要的一点是要避免产生大量非常小的多肽，因为它们难以分析，而且很可能从凝胶中丢失。肽图分析的双向电泳方法请参见 “双向电泳”。
来源：丁香实验
