肿瘤细胞培养实验

肿瘤组织及细胞在模拟体内生长环境的条件下、与一般组织细胞一样、也能够生长发育乃至繁殖、为研究癌变机理、抗癌药检测、肿瘤分子生物学提供大量的实验材料。

肿瘤组织培养液，Hanks，胰蛋白酶，EDTA；胶原酶培养瓶，培养皿，吸管和胶帽，眼科剪，眼科镊，二氧化碳培养箱，超净工作台。

1、将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分。

2、在平皿中用 Hanks 液洗 3 次，剪碎组织，切成 1-2 mm³ 小块。

3、接种于培养瓶（或皿）中，37 ℃、5% CO₂ 或加盖并塞在普通恒温箱中培养。

4、成纤维细胞的排除：

成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法。

① 刮除法：镜下观察肿瘤细胞，并在培养瓶或培养皿底部做下标记，再用无菌胶刮刮除无标记区域。

② 反复贴壁法：肿瘤细胞贴壁速度比成纤维细胞慢，把含有两类细胞的悬液反复贴壁，则成纤维细胞先贴壁而肿瘤细胞后贴壁，来达到分离两类细胞的目的。取 A、B、C 三个培养瓶，先于 A 中接种入两种细胞的无血清培养基悬液，5～20 min 后轻轻将上清液吸出，接种至 B，A 中加入完全培养基继续培养；培养 B 中细胞 5～20 min 后，同样方法将上清接种至 C，再于 C 中加入完全培养基。次日观察三瓶细胞，会发现 A 瓶主要为成纤维细胞，B 瓶两类细胞相杂，C 瓶中主要为肿瘤细胞，如需纯化，可反复处理。

③ 酶消化法：成纤维细胞对酶更为敏感，故加入胰酶或胶原酶消化的时候比肿瘤细胞更易于脱落。可于镜下观察消化，待成纤维细胞脱落即刻终止消化，反复处理几次可得较纯的肿瘤细胞。

（4）复苏、传代和冻存同前。

1、肿瘤细胞的培养也应该遵循无菌操作的原则。

2、肿瘤细胞在体外不容易培养形成稳定的细胞系，故欲获得好的培养效果应采取一些特别的措施，如加入某种特殊的底物，或者加入促细胞生长因子，甚至需要先用动物转嫁接种成瘤以获得更好的活性。

3、因为某些肿瘤是病毒感染导致，所以肿瘤细胞培养时应注意自我防护。

4、取材人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。

5、癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于 4 ℃ 中，但不宜超过 24 小时。

6、培养基肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMI 1640、DMEM、Mc-Coy5A 等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤组织完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子，有的还需特异性生长因子（如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。