原理
在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度(mg/ml 或U/ml)。
材料与仪器
马抗人 IgG 血清
离子琼脂 生理盐水琼脂 PBS 标准参考蛋白
微量加样器 打孔器 湿盒 琼脂板 纱布 泡沫塑料
离子琼脂 生理盐水琼脂 PBS 标准参考蛋白
微量加样器 打孔器 湿盒 琼脂板 纱布 泡沫塑料
步骤
一、实验材料
2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含2%NaN3）。
标准马抗人 IgG 血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）
工作标准参考蛋白（北京生物制品研究所生产）
pH7.2 PBS
打孔器（孔径3 mm）及打孔模板
微量加样器
湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）
已制备好的含有 1%马抗人IgG 抗体的琼脂板
1/50 稀释的单人份待检血清标本
二、实验方法
1、标准曲线的制备
（1）按照玻片的大小，准备制做琼脂板所需要的1%离子琼脂。首先分装其1/2 量的2%盐水琼脂，例如，用普通载玻片制做时需1%离子琼脂4 ml，在分装2%盐水琼脂时即为2 ml。溶化后置56℃~60℃ 水浴中平衡温度备用。
（2）稀释抗体，用pH7.2 的PBS 稀释标准抗人IgG 抗体，终浓度为抗体效价的一倍。例如，血清效价为1/140，原浓血清即应按1/70 稀释。并分装试管，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。
（3）制备琼脂板：将已稀释的抗人IgG 抗体于56℃ 水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持56℃~60℃ 的2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。翻转试管1-2 次，将抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），即刻倾注于玻片上，待凝固后即可。
（4）打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5 个，孔距10 mm。
（5）稀释不同浓度的标准参考蛋白（工作标准）：应根据制品说明进行稀释，例如：工作标准中免疫球蛋白含量，IgG 为100 单位/ml，80.4 微克/单位，其稀释范围为1/10、1/20、1/40、1/80 及1/160。
（6）加样：将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微量加样器每孔加入10 ul。（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。
（7）将加样的琼脂板放湿盒中，置37℃ 温箱，24 小时后观察结果。
（8）用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。
2. 人血清中 IgG 正常值的测定
（1）将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上，每一琼脂板可打孔4 个（孔径3 mm，孔距10 mm）。
（2）将单位正常人血清用pH7.2 PBS 分别作1/50 稀释。
（3）用微量加样器分别取1/50 稀释的单人份血清标本10 μl 加入孔中，每份标本应各加两孔。
（4）作好标记放湿盒中，置37℃ 温箱，24 小时后观察结果。
三、实验结果
测量各份标本的沉淀环直径并记录结果，然后用标准曲线测出每份标本所含IgG 的量（U/ml，），并换算为mg/ml。
2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含2%NaN3）。
标准马抗人 IgG 血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）
工作标准参考蛋白（北京生物制品研究所生产）
pH7.2 PBS
打孔器（孔径3 mm）及打孔模板
微量加样器
湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）
已制备好的含有 1%马抗人IgG 抗体的琼脂板
1/50 稀释的单人份待检血清标本
二、实验方法
1、标准曲线的制备
（1）按照玻片的大小，准备制做琼脂板所需要的1%离子琼脂。首先分装其1/2 量的2%盐水琼脂，例如，用普通载玻片制做时需1%离子琼脂4 ml，在分装2%盐水琼脂时即为2 ml。溶化后置56℃~60℃ 水浴中平衡温度备用。
（2）稀释抗体，用pH7.2 的PBS 稀释标准抗人IgG 抗体，终浓度为抗体效价的一倍。例如，血清效价为1/140，原浓血清即应按1/70 稀释。并分装试管，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。
（3）制备琼脂板：将已稀释的抗人IgG 抗体于56℃ 水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持56℃~60℃ 的2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。翻转试管1-2 次，将抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），即刻倾注于玻片上，待凝固后即可。
（4）打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5 个，孔距10 mm。
（5）稀释不同浓度的标准参考蛋白（工作标准）：应根据制品说明进行稀释，例如：工作标准中免疫球蛋白含量，IgG 为100 单位/ml，80.4 微克/单位，其稀释范围为1/10、1/20、1/40、1/80 及1/160。
（6）加样：将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微量加样器每孔加入10 ul。（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。
（7）将加样的琼脂板放湿盒中，置37℃ 温箱，24 小时后观察结果。
（8）用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。
2. 人血清中 IgG 正常值的测定
（1）将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上，每一琼脂板可打孔4 个（孔径3 mm，孔距10 mm）。
（2）将单位正常人血清用pH7.2 PBS 分别作1/50 稀释。
（3）用微量加样器分别取1/50 稀释的单人份血清标本10 μl 加入孔中，每份标本应各加两孔。
（4）作好标记放湿盒中，置37℃ 温箱，24 小时后观察结果。
三、实验结果
测量各份标本的沉淀环直径并记录结果，然后用标准曲线测出每份标本所含IgG 的量（U/ml，），并换算为mg/ml。
单向免疫扩散示意图
注意事项
1. 在制做标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板。
2. 加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头。
2. 加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头。
常见问题
双向免疫扩散是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原、抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。依据沉淀线的形态、条数、清晰度及位置可了解抗原或抗体的若干性质，如浓度、特异性等。
单向免疫扩散在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg/ml或U/ml）。
应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM的水平。
内容来源：北京大学医学部基础医学院免疫学系。
来源：丁香实验
