单向免疫扩散法（Single radil immunodiffusion）—正常人群IgG正常值检

相关专题

 

【原理】
在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原 ，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，既形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg/ml或IU/ml）。
应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA及IgM的含量及正常值。
【材料】
1．示教部分：
2%离子琼脂 或生理盐水琼脂（内含2‰NaN3）
标准马抗人IgG血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）
参考蛋白工作标准（北京生物制品研究所生产）
pH7.2 PBS
玻璃板或载玻片。
打孔器（孔径3mm）及打孔模板。
微量加样器
湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）
2．实验部分：
已制备好的含有马抗人IgG抗体的1%琼脂板。
1:50稀释的单人份待检血清标本。
打孔器、模板、微量加样器及湿盒等。
【方法】
（一）标准曲线的制备：示教
1．按照玻片的大小，以能制做1~1.5mm厚度的琼脂板的量，分装其1/2量的2%盐水琼脂。例如，用普通载玻片制做时其1%琼脂量为4ml，在分装2%盐水琼脂时既为2ml。溶化后置56~60℃水浴中平衡温度备用。
2．稀释抗体：将标准抗人IgG抗体按其效价用pH7.2 PBS做成1倍稀释。例如，血清效价为1:140，原浓血清既应稀释为1:70。并分装试管，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。
3．制板：将已稀释的抗人IgG抗体于56℃水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持56~60℃的2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。翻转试管1~2次，将抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），迅速倾注于玻片上，待凝固后既制成。
4．打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5个，孔距10mm。
5．稀释不同浓度的参考蛋白标准（工作标准）：应根据制品说明进行稀释，例如：工作标准中免疫球蛋白含量，IgG为100单位/ml，80.4微克/单位，其稀释范围为1:10、1:20、1:40、1:80及1:160。
6．加样：将已稀释的不同浓度的工作标准顺序用微量加样器每孔加入10μl（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。
7．置湿盒中，放37℃温箱，24小时后观察结果。
8．用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，不同单位/ml为横座标，绘制成标准曲线。
在制做标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板。
（二）正常人血清中IgG值的测定：
1．将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上，每一琼脂板可打孔4个（孔径3mm，孔距10mm）。
2．将单份正常人血清用pH7.2 PBS分别作1:50稀释。
3．用微量加样器分别取1:50稀释的单人份血清标本10μl加入孔中，每份标本应各加两孔（每份标本均应更换塑料吸头）。
4．作好标记置湿盒中，放37℃温箱，24小时后观察结果。
【结果】
测量各份标本的沉淀环直径并记录结果，然后用标准曲线测出每份标本所含IgG的单位/ml，并换算为mg/ml。
将全班实验结果做出统计及均值，并写出较完整的实验报告。