Tris-Cl离子交换层析法(Ion-exchange chromatography)

一、材料和试剂
 

1.  DE32或DE52纤维素。
 

2.  HCl；NaOH；0.01～0.05 mol/L，pH8.0 PB；0.01 mol/L，pH8.6 Tris-Cl；0.5 mol/L NaCl。
 

3.  待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
 

4.  1.5x50 cm 层析柱；透析袋；紫外分光光度计及其他透析和层析所需的试剂和器材。
 

二、操作步骤
 

1.  DE52纤维素的处理：DE52经酸、碱处理，0.01 mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡。
 

2.  装柱：将层析柱固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出口接一细塑料管并关闭出水。将浸泡于0.01 mol/L，pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中，待DE52自然沉降3～5 cm高时，吸除0.01 mol/L，pH8.6 Tris-Cl，或松开出水口螺旋夹，控制流速1～2 ml/min，同时连续加入DE52至所需高度。待DE52完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片。
 

3.  平衡：松开出水口螺旋夹，以0.01 mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡，控制流速为15滴/min，待流出液与洗脱液之pH值达到一致时，停止平衡。
 

4.  待提取样品的准备：将蛋白装入透析袋里，置4℃冰箱，对0.01 mol/L pH8.6 Tris-Cl透析过夜。
 

5.  加样、洗脱与收集：用吸管吸去柱面液体，以毛细吸管沿柱壁加入样品，样品体积相当于柱床体积的1%～2%，蛋白浓度为50～70 mg。启开出水口螺旋夹使样品缓慢进入柱床内，并用少量洗脱液清洗柱壁；待液体进入柱床后，以0.01 mol/L，pH8.6 Tris-Cl洗脱，控制流速为14～16滴/min。分部收集器收集，紫外监测，或人工收集，以紫外分光光度计分别测定每管280 nm OD值，描绘洗脱液峰。
 

6.  浓缩：将洗脱液的280 nm OD上峰段与下峰段各管分别合并，装入透析袋，以PEG浓缩至所需体积。