液氮破碎法

1.  酵母在YPD（或选择性）培养基中剧烈振荡下培养至对数中期。离心，弃上清，市售酵母糕可以用来代替培养细胞。

2.  在旋涡混合器上振荡细胞沉淀，使其形成粘稠的细胞糊，必要时，加入最少量的冰水使细胞糊能够倒出或舀出，如果使用酵母糕，用等体积的细胞和水混合使之形成粘稠的细胞糊。在后续步骤中细胞糊的操作应在冰浴中进行。

3.  拔出60 ml 注射器的活塞，用塞子塞住底部或者用Parafilm 膜包紧，加入50 ml的细胞糊。

 

4.  往1 L Nalgene 烧杯中加入400 ml 液氮，将注射器悬于液氮之上，除去底部的塞子或Parafilm 膜，插入活塞，将细胞糊推入液氮中。粘稠的细胞糊会形成长而细的条状物，稀的细胞糊会形成爆米花样的团状物，使用1 L 的混合杯一次最多可处理约200 ml 细胞糊，破菌之前冰冻细胞可于-80℃无限期贮存。

5.  小心将液氮连同冰冻细胞倒入已装好混合器的混合杯中，用前必须彻底干燥（必要时可以在室温下进行）。

 

6.  盖上混合杯的盖子，确定盖孔是打开的，这样液氮蒸发时不会造成压力，将盖子盖紧，髙速连续搅拌3次，每次2 min。在搅拌间隙可混匀冰冻粉，必要时加入液氮刚好覆盖住冰冻粉，倒入液氮之后要尽快开始搅拌以避免冻住可动部分。

7.  搅拌后，将细的冰冻粉倒入盛有两倍于原来细胞糊体积的冰冷的贮存缓冲液的烧杯中，混匀后将悬液倒入离心管置于冰上。

8.  重复步骤3~7，直到处理完所有的细胞糊。

9.  于5 000 g 离心15 min，上清为含蛋白10~20 mg/ml 的粗提液。