亲和素-生物素偶联

1.  在旋转摇床或摆动平台中持续摇动使膜与合适的封闭液平衡。对于硝酸纤维素膜或PVDF膜，需在室温封闭30~60 min。尼龙膜则需在37℃封闭2 h。

2.  用TTBS溶液（用于硝酸纤维素膜或PVDF膜）或TBS溶液（用于尼龙膜）稀释第一抗体。

3.  从封闭液中取出膜，放入第一抗体溶液中。于37℃缓慢摇动30 min。

4.  在TTBS或TBS中洗膜3次，毎次超过15 min。

5.  稀释2滴生物素酰化第二抗体于50~100 ml TTBS或TBS溶液以制备第二抗体工作液。

6.  将膜移入第二抗体工作液。室温中缓慢摇动30 min，然后按步骤4洗膜。

7.  当膜还与第二抗体共育吋，制备亲和素-生物素酰化HRPO或AP的复合物。将2滴Vectastain A试剂和B试剂混合于10 ml TTBS或TBS中，室温故置30 min，然后，进一步稀释于50 ml TTBS或TBS。

8.  将膜移入亲和素-生物素酰化的酶溶液中。室温中慢慢摇动下放置30 min，按步骤4洗膜，但每次超过30 min。 

9.  按合适的显迹方案显影。