【交流】生物素-亲和素系统
丁香园论坛
7099
生物素-亲和素系统的特点
生物素（biontin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244．31kD．生物素分子有两个环状结构（图 11-1），其中Ⅰ环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要郎部位；II环为噻吩环，Ｃ２上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素（图1）。亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD，等电点pＩ=１０.５；耐热井耐受多种蛋白水解酶的作用．尤其是与生物素结合后，稳定性更好。每个亲和素能结合4个分子的生物素，二者之间的亲和力极强，亲和素常数（K）为１０１５Ｌ／mol，比抗原与抗体间的亲和力（K＝10５～１１L／mol）至少高1万倍，因此二者的结合特异性高和稳定性好。亲和索以结合１μg生物素所需的量作为其活性单位，1mg纯的亲和素的活性约为13—15U。
因此，BAS即可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。BAS在实际应用中所具有的巨大优越性，主要表现在以下几个方面。
一、灵敏度
生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
二、特异性
亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
三、稳定性
亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度，
四、适用性
生物素和亲和素均可制成多种衍生物，不仅可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素—受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系，而且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。此外，多种BAS的商品化试剂，为临床检测和科研工作提供了有利条件。
五、其 他
BAS可依据具体实验方法要求制成多种通用性试剂（如生物素化第二抗体等）适用于不同的反应体系，而且都可高度稀释，用量很少，实验成本低；尤其是BAS与成本高昂的抗原特
异性第一抗体偶联使用，可使后者的用量大幅度减少，节约实验费用．此外，由于生物素与亲和素的结合具高速、高效的特性，尽管BAS的反应层次较多，但所需的温育时间不长，实验往往只需数小时即可完成．
生物素的理化性质与标记
生物素及其活化
生物素经恬化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。目前已有商品生物素标记试剂出售，使BAS放大系统得以广泛地应用于免疫化学、分子生物学及生物化学等领域的分析测定技术。
以下介绍几种常用于标记不同类型生物大分子的活化生物索的制备及特性
①标记蛋白质氨基的活化生物素 ②标记蛋白质醛基的活化生物素 ③标记蛋白质巯基的活化生物素④标记核酸的活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
此种活化生物素的制备方法是将生物素与Ｎ－羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物索素Ｎ－羟基丁二酰亚胺酯（biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS）。BNHS分子酯健中的-C=O基团可与蛋白质分于中赖氨酸的氨基形成肽键，从而使蛋白质标记上生物素。若蛋白质含赖氨酸残基多，且等电点PI＞6时，标记效果好。因此，BNHS适用于对抗体和中性或偏碱性抗原的生物素标记。
生物素的分于量较小，当与抗体或酶反应形成生物素标记结合物后．由于大分子蛋白的空间位阻效应（steric hindrance），可对生物素与亲和素间的结合以及BAS的应用效果造成干扰。可通过在生物素分子侧链上连接一定数量的基团，形成连接臂，增加生物素与被标记大分子间的距离（如长臂活化生物素），减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。
长臂活化生物素（N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS）是在生物素和N—羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基己糖分子基团，形成连结臂，使其与抗体、酶等生物大分子结合后，不受位阻效应的影响，更易发挥生物索的活性作用。BCNHS的制备是先用6－氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素，然后再将其活化。
标记蛋白质醛基的活化生物素
用于此类标记的活化生物素有两种：生物衰酰肼（biotin hydrazine，BHZ）和肼化生物胞素（biocyin hydrazine，BCHZ）。BHZ是水合肼（hydraine hydrate）与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。也可在BHZ侧链上添加一个赖氨酸基团作为连结臂，减少标记后的空间位阻，使活化后的生物素能更好地与亲和素结合。
生物胞素（biocytin）是生物素通过-C=O基与赖氨酸的ε－氨基连接而成的化合物，它与无水肼反应后形成的肼化物即为肼化生物胞素（biocytin hydrazine，BCHZ）。BCHZ除可与蛋白质的醛基结合外，它还与BNHS相同，能与蛋白质的氨基结合，因此其适用范围较BHZ宽。
标记蛋白质巯基的活化生物素
３-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素[3-（N-maleimido-propiny）-biocytin，MPB]是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。它是用氯化生物胞素与3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-N-BNHS在二甲基甲酰胺（DMF）溶液中反应后制得的。
标记蛋白质氨基的活化生物素
此种活化生物素的制备方法是将生物素与Ｎ－羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物索素Ｎ－羟基丁二酰亚胺酯（biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS）。BNHS分子酯健中的-C=O基团可与蛋白质分于中赖氨酸的氨基形成肽键，从而使蛋白质标记上生物素。若蛋白质含赖氨酸残基多，且等电点PI＞6时，标记效果好。因此，BNHS适用于对抗体和中性或偏碱性抗原的生物素标记。
生物素的分于量较小，当与抗体或酶反应形成生物素标记结合物后．由于大分子蛋白的空间位阻效应（steric hindrance），可对生物素与亲和素间的结合以及BAS的应用效果造成干扰。可通过在生物素分子侧链上连接一定数量的基团，形成连接臂，增加生物素与被标记大分子间的距离（如长臂活化生物素），减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。
长臂活化生物素（N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS）是在生物素和N—羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基己糖分子基团，形成连结臂，使其与抗体、酶等生物大分子结合后，不受位阻效应的影响，更易发挥生物索的活性作用。BCNHS的制备是先用6－氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素，然后再将其活化。
生物素（biontin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244．31kD．生物素分子有两个环状结构（图 11-1），其中Ⅰ环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要郎部位；II环为噻吩环，Ｃ２上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素（图1）。亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD，等电点pＩ=１０.５；耐热井耐受多种蛋白水解酶的作用．尤其是与生物素结合后，稳定性更好。每个亲和素能结合4个分子的生物素，二者之间的亲和力极强，亲和素常数（K）为１０１５Ｌ／mol，比抗原与抗体间的亲和力（K＝10５～１１L／mol）至少高1万倍，因此二者的结合特异性高和稳定性好。亲和索以结合１μg生物素所需的量作为其活性单位，1mg纯的亲和素的活性约为13—15U。
因此，BAS即可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。BAS在实际应用中所具有的巨大优越性，主要表现在以下几个方面。
一、灵敏度
生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
二、特异性
亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
三、稳定性
亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度，
四、适用性
生物素和亲和素均可制成多种衍生物，不仅可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素—受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系，而且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。此外，多种BAS的商品化试剂，为临床检测和科研工作提供了有利条件。
五、其 他
BAS可依据具体实验方法要求制成多种通用性试剂（如生物素化第二抗体等）适用于不同的反应体系，而且都可高度稀释，用量很少，实验成本低；尤其是BAS与成本高昂的抗原特
异性第一抗体偶联使用，可使后者的用量大幅度减少，节约实验费用．此外，由于生物素与亲和素的结合具高速、高效的特性，尽管BAS的反应层次较多，但所需的温育时间不长，实验往往只需数小时即可完成．
生物素的理化性质与标记
生物素及其活化
生物素经恬化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。目前已有商品生物素标记试剂出售，使BAS放大系统得以广泛地应用于免疫化学、分子生物学及生物化学等领域的分析测定技术。
以下介绍几种常用于标记不同类型生物大分子的活化生物索的制备及特性
①标记蛋白质氨基的活化生物素 ②标记蛋白质醛基的活化生物素 ③标记蛋白质巯基的活化生物素④标记核酸的活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
此种活化生物素的制备方法是将生物素与Ｎ－羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物索素Ｎ－羟基丁二酰亚胺酯（biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS）。BNHS分子酯健中的-C=O基团可与蛋白质分于中赖氨酸的氨基形成肽键，从而使蛋白质标记上生物素。若蛋白质含赖氨酸残基多，且等电点PI＞6时，标记效果好。因此，BNHS适用于对抗体和中性或偏碱性抗原的生物素标记。
生物素的分于量较小，当与抗体或酶反应形成生物素标记结合物后．由于大分子蛋白的空间位阻效应（steric hindrance），可对生物素与亲和素间的结合以及BAS的应用效果造成干扰。可通过在生物素分子侧链上连接一定数量的基团，形成连接臂，增加生物素与被标记大分子间的距离（如长臂活化生物素），减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。
长臂活化生物素（N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS）是在生物素和N—羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基己糖分子基团，形成连结臂，使其与抗体、酶等生物大分子结合后，不受位阻效应的影响，更易发挥生物索的活性作用。BCNHS的制备是先用6－氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素，然后再将其活化。
标记蛋白质醛基的活化生物素
用于此类标记的活化生物素有两种：生物衰酰肼（biotin hydrazine，BHZ）和肼化生物胞素（biocyin hydrazine，BCHZ）。BHZ是水合肼（hydraine hydrate）与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。也可在BHZ侧链上添加一个赖氨酸基团作为连结臂，减少标记后的空间位阻，使活化后的生物素能更好地与亲和素结合。
生物胞素（biocytin）是生物素通过-C=O基与赖氨酸的ε－氨基连接而成的化合物，它与无水肼反应后形成的肼化物即为肼化生物胞素（biocytin hydrazine，BCHZ）。BCHZ除可与蛋白质的醛基结合外，它还与BNHS相同，能与蛋白质的氨基结合，因此其适用范围较BHZ宽。
标记蛋白质巯基的活化生物素
３-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素[3-（N-maleimido-propiny）-biocytin，MPB]是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。它是用氯化生物胞素与3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-N-BNHS在二甲基甲酰胺（DMF）溶液中反应后制得的。
标记蛋白质氨基的活化生物素
此种活化生物素的制备方法是将生物素与Ｎ－羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物索素Ｎ－羟基丁二酰亚胺酯（biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS）。BNHS分子酯健中的-C=O基团可与蛋白质分于中赖氨酸的氨基形成肽键，从而使蛋白质标记上生物素。若蛋白质含赖氨酸残基多，且等电点PI＞6时，标记效果好。因此，BNHS适用于对抗体和中性或偏碱性抗原的生物素标记。
生物素的分于量较小，当与抗体或酶反应形成生物素标记结合物后．由于大分子蛋白的空间位阻效应（steric hindrance），可对生物素与亲和素间的结合以及BAS的应用效果造成干扰。可通过在生物素分子侧链上连接一定数量的基团，形成连接臂，增加生物素与被标记大分子间的距离（如长臂活化生物素），减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。
长臂活化生物素（N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS）是在生物素和N—羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基己糖分子基团，形成连结臂，使其与抗体、酶等生物大分子结合后，不受位阻效应的影响，更易发挥生物索的活性作用。BCNHS的制备是先用6－氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素，然后再将其活化。
