原理
免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。
此实验方案介绍了一种经三步反应的技术，它通过使用链亲和素-第二抗体结合物，然后再与生物素-荧光染料结合物反应，提高了免疫组化反应的敏感度。
材料与仪器
组织样品
生物素 荧光染料 链亲和素
离心机 摇床
生物素 荧光染料 链亲和素
离心机 摇床
步骤
1. 将湿纸巾铺于载玻片盒底部做成加湿盒，由冰冻切片仪中取出载有切片的载玻片，放入玻片盒中（每边放6片），或故湿盒中（载玻片勿相互接触）。
2. 待载玻片达室湿且未干时，铺加PBS于切片上（勿溢出玻片）。
3. 稀释的第一杭体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min（每一载玻片上加40~50 ul 抗体，应能盖住切片）。
4. 用与泵相连的巴斯德吸管，在切片的一端吸去玻片上的PBS，并从另一端加上抗体，盖上加湿盒，室温温育1 h。
5. 以PBS冼玻片3次（5 min/次），从切片一端加入新的PBS缓冲液，由另一端吸去旧的缓冲液。
6. 稀释的生物素酰化第二抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min（每一载玻片用40~50 ul抗体）。
7. 加第二抗体于切片上，置加湿盒中，室温温育1 h。
7. 加第二抗体于切片上，置加湿盒中，室温温育1 h。
8. 以PBS洗玻片3次（毎次洗15 min）加荧光染料-链亲和素于切片上（每一载玻片用40~50 ul 抗体）。置加湿盒中、室温温育1 h，以PBS洗玻片3次。
9. 将盖玻片放于纸巾上，滴加1滴Gelvatol 于盖玻片中央。翻过载玻片放于盖玻片上（勿施压），将玻片置工作台上，用铝箔覆盖避光放置30 min，使Gelvatol 凝结。
9. 将盖玻片放于纸巾上，滴加1滴Gelvatol 于盖玻片中央。翻过载玻片放于盖玻片上（勿施压），将玻片置工作台上，用铝箔覆盖避光放置30 min，使Gelvatol 凝结。
10. 显微镜下观察结果，或置玻片盒中贮于4℃。
注意事项
1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：
(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;
(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;
(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
来源：丁香实验
