材料与仪器
DNA
磷酸酶缓冲液 封阻液 牛血清蛋白 TE NBT
离心机 分光光度计 摇床
磷酸酶缓冲液 封阻液 牛血清蛋白 TE NBT
离心机 分光光度计 摇床
步骤
1. 用DNA稀释缓冲液，稀释生物素酰化标准DNA，浓度为0、1、2、5、10和20 pg/μl。以同样稀释液处理待测DNA。
2. 对干硝酸纤维素滤膜：每个稀释度取1 μl 点膜，在80℃供干约1 h接步骤4。
2. 对干硝酸纤维素滤膜：每个稀释度取1 μl 点膜，在80℃供干约1 h接步骤4。
3. 对于足龙膜：每个稀释度取1 μl 点膜，晾干后用紫外照射法将DNA交联至膜上。接步骤4或化学发光检测。
4. 用少量体枳AP7.5液沆膜1 min，在密封袋中（剪成合适大小），用10 ml 封阻液，37℃封闭1 h 注意排出气泡。
5. 稀释10 μl 亲和素-AP交联物至10 ml AP7.5。剪去封闭袋一角挤出封闭液，用亲和素-AP交联物代替，重新封口，在旋转平台室温揺荡10 min。
6. 从袋中取出滤膜移到一个浅盘中，用200 ml AP7.5冼2次，每次15 min。再用 200 ml AP9. 5洗1次，10 min，轻微摇荡。
7. 加入33 μl 75mg/ml 的NBT至7.5 ml AP9.5液中，混匀。再加入25 μl 50 mg/ml BCIP，混匀。
8. 在浅盘中避光温育溶液，不时观察直至发色达到满意程度为止。
5. 稀释10 μl 亲和素-AP交联物至10 ml AP7.5。剪去封闭袋一角挤出封闭液，用亲和素-AP交联物代替，重新封口，在旋转平台室温揺荡10 min。
6. 从袋中取出滤膜移到一个浅盘中，用200 ml AP7.5冼2次，每次15 min。再用 200 ml AP9. 5洗1次，10 min，轻微摇荡。
7. 加入33 μl 75mg/ml 的NBT至7.5 ml AP9.5液中，混匀。再加入25 μl 50 mg/ml BCIP，混匀。
8. 在浅盘中避光温育溶液，不时观察直至发色达到满意程度为止。
9. 加TE pH8.0以终止反应，比较测定DNA样品和标准DNA的颜色强度以确定生物素酰化dNTP的掺入效率。如果该探计至少有一半标准品的强度，它可作为探针用于原位杂交。
来源：丁香实验
