材料与仪器
孕鼠 新生小鼠
RPMI1640培养基 牛血清 胰蛋白酶 Hanks液 酒精 青霉素 链霉素
培养瓶 青霉素瓶 废液缸 血球计数板 蜡盘 手术器械 大头针 离心管 小玻璃漏斗 三角烧瓶 平皿 吸管 试管 移液管 无菌纱布 无菌眼科剪
步骤
一、将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
二、用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
三、用手术剪将肝脏剪成小块（1 mm2），再用Hank's液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
四、将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。
五、翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。
六、于37℃静置3-5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
五、翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。
六、于37℃静置3-5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
注意事项
1. 严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%~5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
2. 严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。
3. 吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；吸取液体时，避免瓶口和吸管碰撞。
4. 离心管入台前，管口、管壁应消毒。
5. 实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。
6. 使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。
7. 器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。
8. 超净台内温度、湿度较大，在夏天工作时台内散热更慢，因此进行细胞悬液混匀、接种时，离火焰要稍微远些。
常见问题
一、操作要领
1. 混匀操作要领
（1）火焰消毒吸管，用Hank's液冷却和湿润管内壁（这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上）。
（2）吸管头插入管底。
（3）用吸管反复轻轻吹打组织块。
2. 器械的使用
（1）用工作台消毒镊子取浸泡在酒精中消毒的器械。
（2）器械置无菌干纱布内嚓一下。迅速通过火焰，冷却后使用。
（3）用过的器械置另一加盖的器皿中再消毒。
（4）器械按浸泡消毒的顺序使用。
（5）各套再消毒器械不可混用。
3. 除去组织块多余水分
用吸管将组织块推向青霉素瓶一角，然后将有组织块的瓶面翻向上方，吸去流向对侧的多余水分。
注意：多余水分若不除去，会使组织块剪切不细，消化后的细胞悬液清亮（细胞数少），并可见消化液中有线状或絮状物漂浮。
4. 细胞计数
（1）用吸管混匀待计数的细胞悬液。
（2）将一小滴细胞悬液从盖玻片与载玻片交界部位滴入细胞计数池中。
（3）沉降1分钟，低倍镜下计数血球计数板四大中格的结构完整的细胞，小细胞团计数为1。
（4）计数时，如果细胞压在格上，则数上不数下，数左不数右。然后按下式计算出每毫升悬液中的细胞数。
（四大中格细胞数/4）10_000~L细胞数/毫升
来源：丁香实验
