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组织块直接培养法

相关实验:细胞原代培养实验

最新修订时间:

材料与仪器

孕鼠 新生小鼠
RPMI1640培养基 牛血清 胰蛋白酶 Hanks液 酒精 青霉素 链霉素
培养瓶 青霉素瓶 废液缸 血球计数板 蜡盘 手术器械 大头针 离心管 小玻璃漏斗 三角烧瓶 平皿 吸管 试管 移液管 无菌纱布 无菌眼科剪

步骤

 
一、将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死,置75%酒精泡2-3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏,置平皿中。
 
二、用Hank's液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。
 
三、用手术剪将肝脏剪成小块(1 mm2),再用Hank's液洗三次,转移至小青霉素瓶中。
 
四、将组织块转移到培养瓶,贴附与瓶底面。

五、翻转瓶底朝上,将培养液加至瓶中,培养液勿接触组织块。

六、于37℃静置3-5小时,轻轻翻转培养瓶,使组织浸入培养液中(勿使组织漂起),37℃继续培养。

注意事项

1.  严格进行动物皮肤消毒,使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒,成年鼠先用3%~5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
 
2.  严格进行无菌操作,防止细菌、霉菌、支原体污染,避免化学物质污染。
 
3.  吸取液体前,瓶口和吸管进行火焰消毒;吸取液体时,避免瓶口和吸管碰撞。
 
4.  离心管入台前,管口、管壁应消毒。
 
5.  实验者离开超净台时,要随时用肘部关闭工作窗。
 
6.  使用过的器械用酒精棉球擦去血污后,移入另一个器皿中继续消毒,在浸泡器械时剪刀口要叉开放,镊子弯头要向下放,并加盖消毒。
 
7.  器材使用时既要注意用火焰消毒,又要防止烫伤、烫死细胞。经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。
 
8.  超净台内温度、湿度较大,在夏天工作时台内散热更慢,因此进行细胞悬液混匀、接种时,离火焰要稍微远些。

常见问题

一、操作要领

1.  混匀操作要领

(1)火焰消毒吸管,用Hank's液冷却和湿润管内壁(这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上)。
 
(2)吸管头插入管底。
 
(3)用吸管反复轻轻吹打组织块。
 
2.  器械的使用
 
(1)用工作台消毒镊子取浸泡在酒精中消毒的器械。
 
(2)器械置无菌干纱布内嚓一下。迅速通过火焰,冷却后使用。
 
(3)用过的器械置另一加盖的器皿中再消毒。
 
(4)器械按浸泡消毒的顺序使用。
 
(5)各套再消毒器械不可混用。
 
3.  除去组织块多余水分
 
用吸管将组织块推向青霉素瓶一角,然后将有组织块的瓶面翻向上方,吸去流向对侧的多余水分。
注意:多余水分若不除去,会使组织块剪切不细,消化后的细胞悬液清亮(细胞数少),并可见消化液中有线状或絮状物漂浮。
 
4.  细胞计数
(1)用吸管混匀待计数的细胞悬液。
 
(2)将一小滴细胞悬液从盖玻片与载玻片交界部位滴入细胞计数池中。
 
(3)沉降1分钟,低倍镜下计数血球计数板四大中格的结构完整的细胞,小细胞团计数为1。
 
(4)计数时,如果细胞压在格上,则数上不数下,数左不数右。然后按下式计算出每毫升悬液中的细胞数。
(四大中格细胞数/4)10_000~L细胞数/毫升
 

来源:丁香实验

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