肿瘤细胞体外传代培养及保种技术

一、细胞复苏与培养

将液氮或-80℃保存的肿瘤细胞于37℃ 水浴, 快速溶化, 用8.0ml 培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液, 于1500 转/分, 离心3 分钟。弃上清, 再吸取8.0ml 培养基质混匀细胞沉淀, 再1500 转/分, 离心3 分钟, 弃上清, 细胞沉淀用1.0ml 培养基混匀, 备用。另取一个75cm2 方瓶, 加入14.0ml 培养基质, 将上述制备的含肿瘤细胞悬液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37℃，5%CO2 孵育箱中培养。若此肿瘤细胞悬浮生长, 大约3－4 天细胞基质会变黄, 5.0ml 细胞悬液可传代一个方瓶培养, 可用3－4 个方瓶培养, 一个方瓶中呈对数生长的肿瘤细胞可达1-1.5x10⁷ 个, 根据试验所需, 可决定传代的次数。若此肿瘤细胞呈贴壁生长, 经过3-4 天, 肿瘤细胞生长至80%-95% 单层时, 弃上清, 用0.5mM 的EDTA(难消化的肿瘤细胞用0.25%胰酶1.0ml), 处理肿瘤细胞大约3-5 分钟, 用倒置显微镜观察，当90% 的肿瘤细胞变圆时, 即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml 离心管中, 于1500 转/分下，离心3 分钟, 弃上清, 加少许培养基混匀, 可传代3 个 75cm²方瓶扩大培养。

二、细胞冻存

将对数生长的肿瘤细胞用1 个75cm²方瓶按上述方法收集, 于1500 转/分离心3 分钟,弃上清, 用保种液(含10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混匀, 分别加入到2-3 只保种管中, 写上肿瘤细胞名称, 时间, 保种者姓名, 放-80℃保存, 次日将它们转移到液氮中保存(注: -80℃下可保存细胞半年至一年, 液氮可保存细胞5-10 年, 甚至更长的时间)。以上所有物品均需经过高温灭菌( 121℃, 30 分钟)，培养基质则经过过滤(0.22uM)除菌, 所有操作均必须遵守无菌操作技术, 避免细菌、真菌、病原体、衣原体等污染。