细胞破碎和蛋白质溶解实验

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

为了纯化细胞蛋白质，采用有效的方法进行细胞破碎和固液分离是必要的。它是全过程的第一步，通常是将处于细胞不同位置的待纯化蛋白释放出来，溶入已知成分的溶液内。该步骤是目的蛋白初级分离纯化阶段的重要环节，它直接影响产物的回收率，也可能影响产物的纯度。

来源：《蛋白质技术手册》

来源：丁香实验

操作方法

匀浆法

1. 用组织剪或芋术刀迅速将清洗的组织分离成适宜的小块，如 1 cm3；2. 每体积湿重组织通常加 3～5 倍体积预冷的匀浆缓冲液至匀浆容器内；3. 制备匀浆：3.1 电力驱动的玻璃匀浆器以 500～1500 r／min 的速度，匀浆 3～6 次，每次 5～10 s 。3.2 手动玻璃匀浆器匀浆 10 ～20 次。3.3 刀片式组织破碎匀浆器和内切式组织匀浆器以 1000～3000 r／min

超声法

1. 清洗后的组织用搅切机切碎成小块，混悬在至少两倍体积的缓冲液内；洗去培养液的细胞（细菌混悬在至少两倍体积的缓冲液内；2. 将超声探头没入混悬液内，进行超声破碎。一般总超声时间约分为几个周期，如 4 × 30 s，周期之间让样品在冰浴中冷却。

高压匀浆法

1. 用裂解缓冲液混悬清洗过的细胞。通常细胞湿重（g ）与缓冲液体积（ml）之比的范围是 1/1 到 1/4； 2. 加样品液进入高压室，并提升压力至预定值（一般 0.55×108～1.38×108 Pa）； 3. 维持上述压力，调整出口流速为每分钟 2～3 ml（约每秒 1 滴）。

研磨法

1. 加 20 g 淸洗过的细胞入预冷的研钵内；2. 准备 40 g 石英沙或氧化铝；3. 在研磨细胞的过程中逐步加入石英沙或氧化铝，即边研磨边加入。加完磨料再继续研磨几分钟；4. 用 60 ml 缓冲液混悬细胞糊，离心除去细胞碎片和磨料。

（高速）珠磨法

1. 0.1～3 g 湿重细胞混悬在等体积缓冲液内。容器建议选用结实的聚乙烯试管；2. 每克湿重细胞加入 1～3 g 预冷的玻璃珠；3. 用混旋搅拌器最大强度混旋 3～5 次，每次 1 min，两次之间置冰上冷却 1 min。

酶溶法

1. 混悬洗过的大肠杆菌于 TE 缓冲液内，每克细菌需 3 ml 缓冲液。调整温度至 20℃～37℃；2. 每 5 ml 混悬液加入1 mg 溶菌酶，可以从新配制 10 mg／ml 的母液吸取或直接用酶的冻干粉；3. 在 20℃～37℃ 温育 10～20 min，同时轻轻摇动。

化学渗透法

1. 用缓冲盐液（TBS：10 mmol／L pH7.5 Tris-HCl，150 mmol／L NaCl） 4℃：洗细胞几次；2. 离心除去缓冲盐液，在含 0.1 ％～0.3 ％ Triton X-100 的缓冲盐液（TBS）中混悬细胞（107～ 108 细胞／ml 或总蛋白 3 ～ 4 mg／ml）；3. 混旋或颠倒试管几次后，冰浴中孵育 10 ～60 min。