用于 PCR 的模板 DNA 制备实验

实验分类：

DNA 实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

模板 DNA 质量直接影响 PCR 结果，是 PCR 成功的关键之一。根据其检测对象（组织细胞材料）的不同，有不同的制备方法，常用的材料有石蜡切片、冰冻切片、血细胞、胸腹水等。

来源《免疫组织化学实验技术及应用》

来源：丁香实验

操作方法

酚-氯仿法提取石蜡组织中 DNA

1. 10 mm 厚石蜡切片 10～15 张，置入消毒后的 1.5 ml Eppendorf 管中。2. 脱蜡二甲苯 1200 μl，9000 r/min，8 min×3。3. 脱水无水乙醇 1200 μl，9000 r/min，5 min×3。4. 打开 Eppendorf 管盖子，将其置于 37℃ 烤箱中干燥 1～2 h。5. 加裂解液 100μl，混匀后加 20 mg/ml 蛋白酶 K 1

改进的石蜡切片 DNA 提取方法

1. 5 μm 厚的石蜡切片 5 至 10 张贴在干净的载玻片上，常规烘片，脱蜡，水化，蒸馏水清洗，无菌蒸馏水浸泡，取出晾至半干。2. 无菌尖头刀片刮下，放入 300～900 μl 组织裂解液中，并加入 20 mg/ml 蛋白酶 K（PK）10～15 μl，封口膜封口，置 55℃ 3 h 以上。3. 其间用指轻弹离心管以利裂解。若有沉淀，再加入 5～10 μl 蛋白酶 K，直至无沉淀已澄清为止。4

直接法（DNA 免提法）

1. 标本太少时，可将一张石蜡切片经脱蜡，水化，蒸馏水清洗，无菌蒸馏水浸泡，取出晾至半干。2. 加入 20～80 μl 直接裂解液中，加 20 mg/ml 蛋白酶 K 0.2～1 μl，放置 55℃ 裂解 3 h 以上；100℃10 min 灭活蛋白酶 K；10000 r/min 离心 10 min，直接用上清液作模板 DNA。（直接组织裂解液配制：TE 中加入 0.1％ Tween-20 或 5

冰冻片（用于 PCR 的模板 DNA 制备实验）

1. 将 10 μl 冰冻切片直接放入含组织裂解液的离心管中。 2. 无菌尖头刀片刮下，放入 300～900 μl 组织裂解液中，并加入 20 mg/ml 蛋白酶 K（PK）10～15 μl，封口膜封口，置 55℃ 3 h 以上。 3. 其间用指轻弹离心管以利裂解。若有沉淀，再加入 5～10 μl 蛋白酶 K，直至无沉淀已澄清为止。 4. 灭活蛋白酶 K 裂解液中含有蛋白酶 K，需放入沸水中 10

含血标本

1. 3 ml 外周血或 1 ml 骨髓液放入含 50 μl 0.5mol/L EDTA 的无菌离心管（15 ml 管）中。2. 2000 r/min 离心 10 min。吸去血浆，用指弹匀剩余的有核细胞和红细胞，加入红细胞溶解液 10 ml 并混匀，常温下放置 30 min。红细胞溶解液配制：NH4Cl 4 g，NH4ClO4 3 g，NH4HCO3 0.04 g，加水定容至 1L；灭菌；4℃

胸腹水或尿液

1. 标本 10 ml 以上，2000 r/min 离心 10 分钟，倒去上清液。用指弹匀沉淀物，加入适量组织裂解液，37℃ 下放置半小时以上。2. 无菌尖头刀片刮下，放入 300～900 μl 组织裂解液中，并加入 20 mg/ml 蛋白酶 K（PK）10～15 μl，封口膜封口，置 55℃ 3 h 以上。3. 其间用指轻弹离心管以利裂解。若有沉淀，再加入 5～10 μl 蛋白酶 K，直至无沉淀