制备 DNA 测序模板实验

实验分类：

DNA 实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

本实验包含了用于制备适用于双脱氧测序的模板及适用于末端标记和化学测序的DNA的实验方案。所有用于双脱氧测序的双链模板在与引物退火前必须变性，在一般应用上，碱变性在测序中的效果比热变性好。

来源：丁香实验

操作方法

制备单链M13噬菌体DNA

1. 如果起始用M13复制型DNA或M13单链DNA，以0.5 ng 重组M13mp复制型DNA或5~10 ng 单链DNA转化40 μl 感受态大肠杆菌DH5αF'株，按热休克方案进行转化。 2. 转化细胞加0.2 ml大肠杆菌DH5αF'过夜培养物后，混匀于3 ml H顶层琼脂，倾倒于37℃平板，倒扣后置于37℃过夜。 3. 大肠杆菌DH5αF'过夜培养物以2×TY培养液稀释

小量裂解物中制备λ噬菌体DNA

1. 在新鲜配制的λ顶层琼脂糖和λ琼脂糖平板上，通过在平板上裂解适于λ噬菌体生长的大肠杆菌菌株，制备重组λ噬菌体毒种原液。 2. 取700 μl 毒种液加入无菌的1.5 ml 微量离心管中，加入1 μl 1 mg/ml 的DNA酶Ⅰ及1 μl 1 mg/ml 热处理过的RNA酶A，于37℃温育30 min。 3. 加入700 μl λPEG溶液，冰浴放置1 h。 4. 4

双脱氧测序的双链质粒DNA的碱变性

1. 加入约0.5 pmol 重组质粒DNA于0.5 ml 微量离心管中，如果体积大于20 μl 应以乙醇沉淀，重溶于20 μl 水。 2. 如果体积小于20 μl，用水补足20 μl。 3. 加入2 μl 2 mol/l NaOH / 2 mmol/l EDTA，用微量移液器上下抽吸轻轻混匀，于25~37℃温育5 min 后，样品置于冰浴，加入水，用微量移液器彻底混匀。 4