材料与仪器
重组λ噬菌体
DNA酶Ⅰ RNA酶Ⅰ PEG SM SDS EDTA 异丙醇 乙酸钠 TE
巴斯德吸管 试管 离心机
DNA酶Ⅰ RNA酶Ⅰ PEG SM SDS EDTA 异丙醇 乙酸钠 TE
巴斯德吸管 试管 离心机
步骤
1. 在新鲜配制的λ顶层琼脂糖和λ琼脂糖平板上，通过在平板上裂解适于λ噬菌体生长的大肠杆菌菌株，制备重组λ噬菌体毒种原液。
2. 取700 μl 毒种液加入无菌的1.5 ml 微量离心管中，加入1 μl 1 mg/ml 的DNA酶Ⅰ及1 μl 1 mg/ml 热处理过的RNA酶A，于37℃温育30 min。
3. 加入700 μl λPEG溶液，冰浴放置1 h。
2. 取700 μl 毒种液加入无菌的1.5 ml 微量离心管中，加入1 μl 1 mg/ml 的DNA酶Ⅰ及1 μl 1 mg/ml 热处理过的RNA酶A，于37℃温育30 min。
3. 加入700 μl λPEG溶液，冰浴放置1 h。
4. 4℃高速离心10 min，弃上清。再于4℃高速离心2 min，用拉细了的巴斯德吸管吸去残余上清。
5. 重悬噬菌体沉淀于500 μl SM 培养液，加入55 μl 10%SDS，0.5 μl 0.5 mol/l EDTA，轻轻混匀，于65 ℃保温15 min，不时轻轻摇匀溶解所有沉淀物。
6. 加入缓冲液平衡酚，用旋涡混合器剧烈振荡来抽提。
7. 室温高速离心2 min 将上层水相移入一个干净微量离心管中，重复用500 μl 1：1酚/氯仿抽提，再重复用500 μl 氯仿抽提。
6. 加入缓冲液平衡酚，用旋涡混合器剧烈振荡来抽提。
7. 室温高速离心2 min 将上层水相移入一个干净微量离心管中，重复用500 μl 1：1酚/氯仿抽提，再重复用500 μl 氯仿抽提。
8. 加入50 μl 3 mol/l pH7.0乙酸钠缓冲液，随后加入550 μl 异丙醇，于-20℃冰冻30 min。
9. 于4 ℃高速离心15 min，吸出并弃上清，晾干DNA沉淀。
10. 重悬沉淀于50 μl pH8.0的TE缓冲液。
10. 重悬沉淀于50 μl pH8.0的TE缓冲液。
11. 用于测序时，在碱溶液中变性0.1~0.3 pmol DNA（2~4 μg）。
来源：丁香实验
