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从大规模裂解物中制备λ噬菌体颗粒

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材料:

1. 缓冲液和溶液:氯仿;NaCl(固体);聚乙二醇(PEG 8000);SM

2. 酶和缓冲液:胰Dnase I (1mg/ml);胰Dnase I (1mg/ml)于TE中(ph7.6)

3. 离心机和转子:Sorvall GSA 转子或相当型号

4. 专用设备:量筒(2L)

5. 载体和菌株:大肠杆菌培养物,经λ噬菌体感染和裂解

方法:

用PEG沉淀噬菌体颗粒:

1、 将含有λ噬菌体的裂解培养物冷却至室温,加胰Dnase I和Dnase 至终浓度约为1µ g/ml,室温温育30min。

2、 每500ml培养物加入29.2固体NaCl(终浓度为1mon/L),搅拌使其溶解。将培养物冰浴1h。

3、 4℃,11000g(8300r/min于Sorvall GSA转子中)离心10min以去除细胞碎片,将四份培养物的上清混合置于2L的干净量筒中。

4、 测定所收集上清的总体积,然后转移至2L的烧瓶中,加固体PEG至终浓度为10%(m/V,加500ml上清加50gPEG),于室温用磁力搅拌器慢慢搅拌溶解PEG。

5、 将噬菌体/PEG溶液转移至聚丙烯离心管中,于冰水浴冷却,至少放置1h以便使噬菌体颗粒发生沉淀。

6、 4℃,11000g(8300r/min于Sorvall GSA转子中)离心10min以回收沉淀的噬菌体,去上清,将离心管倒过来倾斜放置5min,以便是剩余液体充分流干。用移液器吸取残余的液体。

用氯仿抽提细菌碎片:

7、 用一带橡皮球的宽口吸干将噬菌体沉淀轻轻地重悬于SM中(针对步骤3每500ml上清加8ml SM),将离心管倾斜放置,使SM完全覆盖并浸泡噬菌体沉淀,室温放置1h。

通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬浮液中的PEG和细胞碎片,温和振荡30s。4℃,3000g(4300r/min于Sorvall GSA转子中)离心15min以分离有机相和亲水相,回收含噬菌体颗粒的亲水相。

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