纳米脂颗粒的制备

纳米脂颗粒的制备

材料

试剂

阳离子脂质（5m g /m l )

阳离子脂质可以是对还原剂敏感的脂质，如 TC L, 或者是对还原剂不敏感的脂质，如 1，2-二油酰基-3-三甲基胺 丙 烷（ D O T A P ) (图 I D ) 。 T C L 脂 质 ：（2-氨乙基)-二甲基-(2-[3-胆固醇二硫乙基胺 ] ) 溴化铵盐酸 盐 参 照 文 献 方 法 合 成（H u a n g etaL 2005)， 溶 于甲醇/氯仿(1 : 1， VAO 中 ，制备 5 m g / m l 的储存 液 。 D O T A P (AvantiPolarLipids [Alabaster，Alabama]) 溶 于氯仿，制备 5 mg/m l 的储存 液 。

氯 仿

乙醇

辅 助 脂 质（l 〇 m g /m l)

膜 融 合 脂 质 1, 2-二 油 酰 基 甘 油 基 -3-磷 酯 酰 乙 醇 胺（DOPE) ( 图 1E) 是广泛使用的能促进基因转染效率的辅助脂质。 DOPE (Avanti Polar Lipids) 具有相对较小的亲水头部,相信可以诱导细胞膜融合，从而在基因传递的过程中帮助 D N A 从内含体逃逸进人细胞质。
D O PE 可以溶解于氯仿中，制备 5 mg/ml 的储存液。

配 体 -P E G 脂 质（0.05m m o l/L )

T A T 多肽的序列是 CGGGRKKRRQRRRGYG。它 可 以 通 过 N 端半胱氨酸残基连接到马来酰亚胺官能化的 PEG 脂质： 1, 2-二 硬 脂 酰 基 甘 油 基 -3-磷酯酰乙醇胺^N-马 来 酰 亚 胺（聚乙二醇）2000 (AvantiPolarLipids) 制 备 「TAT-PEG■脂质」。要了解更多的化学反应，请查阅参 考 文 献 Hermanson, (1996)。 「T/f f -P E O 脂质」可以溶解于甲醇/氯 仿（ I : I , V/V)溶液 ，制 备 0 . 0 5 1 / L 的储存液。其他配体-PEG 脂 质 可 替 代 「TAT-PEG•脂质」使用。

哺乳动物细胞（处于指数增长期）

小 鼠（雌性， 6〜8 周龄）

甲醇

P E G 化 脂 质（10m g /m l)

P E G 化脂质既可以是对低 PH 敏感的脂质，如 PODS (图 1A) , 也可以是对 p H 不敏感的脂质 ，如 P E O l, 2-二硬脂酰基-«r 甘油基-3-磷 酯 酰 乙 醇 胺（PEODSPE) (图 IB)。 PO D S 的合成方法可以参照文献 Guo et al. (2004)。 P E O D S P E 可 以 从 Avanti Polar Lipids 公司购买 。 P E G 化脂质的 P E G 链段分子质量为 2000。这 些 P E G 化脂质可以 lOmg/m l 的浓度溶解在氯仿中。

质 粒 D N A (A d v y s i s 或其他的基因载体生产商）

实验室提纯质粒 DNA, 推荐使用商业 D N A 纯化试剂盒纯化。

s i R N A 或寡核苷酸（Invitrogen 或其他寡核苷酸生产商）

I O X T r i s 缓 冲 液（50m m o l /L , p H 7. 4 或 8. 5)

pH 7. 4 缓冲液用于制备含有对 PH 不 敏 感 P E G 脂 质 的 N LP, 而 pH 8. 5 缓冲液用于制备含对 低 P H 敏 感 性 的 P E G 脂 质（PODS) 的 N LP。使 用 前 将 IOXTris 缓 冲 液 稀 释 成 I X 缓冲液 。预 留 5 ml IXTris 缓 冲 液（用 孔 径 0. 22_的 滤 膜 过 滤 ）悬浮脂质和溶解 D N A 。

I O X T r i s 缓 冲 生 理 盐 水（T B S ) ( p H 7. 4 或 8. 5)

50m m o l / L Tris

I. 5m o l / L N a C l

调 节 p H 到 7. 4 或 8.5。 p H 7. 4 缓 冲 液 用 于 制 备 含 有 对 p H 不 敏 感 P E G 脂 质 的 N LP，而PH 8.5 缓冲液用于制备含对低 PH 敏 感 性 的 P E G 脂 质（PODS) 的 NLP。使用前稀释成
I X 缓冲液。

仪器

透 析 装 置（Pierce)

透析装置包括一个截留分子质量 10 0 0 0 的 Slide^A-Lyzer 透析管和一个浮盖。

恒 温 水 浴（55°C )

旋 转 蒸 发 仪（Brinkmann Instirumenl:)

脂质干燥装置是用来除掉脂质混合物中的大量溶剂，以及用来在玻璃表面沉积脂质薄膜。脂质薄膜沉积到耐真空玻璃圆底烧瓶（300 ml) 中，干 燥 至 少 3 h , 以除去薄膜中痕量的有机溶剂。

无 菌 注 射 器（3m l ) 和 针 头（18 G I.5) (Beckon Dickinson)

方法

乙醇透析法包载核酸到 N L P

1.从储存液中吸取 P E G 化脂质、阳离子脂质和 D O P E ，置于带螺帽的 16mmX I O O m m玻 璃 管（使用前要清洗及灭菌）中充分混合，减压下使用旋转蒸发仪干燥除去溶剂。随后将此含有脂质薄膜的玻璃管在更高真空下干燥至少 3 h , 最好是干燥过夜。典 型的制备含 20umol总脂质，其中脂质摩尔比例是： P E G 化 脂 质 ：阳离子脂质：辅助脂质=10 : 50 : 40 或者 10 : 30 : 60。

使用玻璃移液管量取和转移溶于有机溶剂中的脂质。每次操作以后，必须马上用聚四氟乙烯带密封脂质储存液，并 储 藏 在 一 2 0 ℃ 。如 果 样 品 中 同 时 含 有 T C L 和 PODS, 为避免PODS 在干燥过程中发生降解，应 在 加 人 PODS 之 前 先 在 脂 质 混 合 液 中 加 入 吗 啉（与 TCL的摩尔比为 20 : 1)。

2.将干燥后的脂质溶解于无水乙醇 30m i n ，再用移液管加入 0.5m l I X T r i s 缓冲液，迅速用最大速度涡旋 2m i n ，以形成脂质单相溶液（溶 液 A )。

如果要加速脂质在乙醇中的分散，可以在混合 T ris 缓冲液之前，在氩气保护下将含有 TCL的脂质混合液于约 65°C 下 加 热 0.5 min, 然后室温下自然冷却 5 min。部分脂质在冷的乙醇中沉淀下来是比较常见的现象。

3.溶 解 I.I O O m g 核 酸（质粒 D N A 或其他寡核苷酸）于 0 •5m l I X T r i s 缓冲液和 0. 5m l乙醇的混合液中（溶液 B )。

在样品的制备过程中，拧 紧 溶 液 A 和 溶 液 B 的盖子，以减少乙醇的挥发。

4.典型的制备方法是，在 I s 内用带 18 G L 5 针头的 3m l 注射器将 D N A 溶 液（溶 液 B )注射到脂质溶液（溶 液 A ) 中。为了使其充分乳化，在 15s 内用注射器反复吸取和吹打混合溶液 10 次，再用最大速度将混合溶液涡旋 30s。

5.用带 18 G 1. 5 针头的 3m l 注射器将脂质- D N A 混合溶液转移到 S l i d e A-L y z e r 透析管中。用 I L 的 I X T r i s 缓冲液在 4°C 下透析 2d , 期 间 4 次更换透析缓冲液。

在使用之前把透析管浸没在透析缓冲液中，保 持 30s , 让其充分水和。要特别注意的是在转移溶液的过程中不要让针头碰到透析膜。

6.更换透析缓冲液，用 I L I X T B S 缓冲液替代 I X T r i s 缓冲液，在 4°C 下继续透析过夜。IX T B S 缓 冲 液 中 含 有 150mmol/L 的 NaCl, 比 低 离 子 强 度 的 I X T r is 缓冲液更适合体内
给药。

7•用带 18 G 1. 5 针头的 3m l 注射器将 N L P 样品从透析管中吸取，转移到有螺帽的灭菌管中，并储存在 4°C 。

通过二硫键交换反应对 NLP 表面进行修饰

8• 还 原 试 剂 现 配 现 用 。用 纯 水 或 PH 为 8. 5 的 I X T B S 缓 冲 液（对 于 含 有 P 0 D S 的 样品）制备 0.1〜〇.2m o l/L 的半胱氨酸溶液。

9•按摩尔比为 1 〇: 1 (1 〇倍 N L P 中 T C L 的量）的比例在 N L P 溶 液（步 骤 7 ) 中加人还原试剂。涡旋混合 10s，室温下放置 5m i n , 然后将样品转移到透析管中，迅速用I L I X T B S 缓冲液 4°C 透 析 I d 除去过量的还原试剂，其间更换一次透析缓冲液。

在 N LP 表 面 插 入 「配体-PEG-脂质」

10•先确定 T A T 多肽-P E & •脂质的量，它的量等于 N L P 脂质总量的 0 •3 % 。转移含上述量的 T A T 肽-P E G -脂质储存液到 16m m X 10 〇 m m 带有螺帽的灭菌玻璃管中。在减压下旋转蒸发除去有机溶剂，然后高真空下干燥过夜。

11•在室温下直接用 N L P 溶液将 T A T - P E O D P P E 脂质薄膜水化作用 I O m i n , 然后在55°C 水浴中培育化。确定在操作中，螺帽密封之前充氩气或者氮气。在培育过程中，每 隔 I O m i n 将玻璃管取出涡旋 10s。

这些处理方法会使 TAT-PEG 脂质通过胶束转换作用从玻璃表面转移到 N L P 中。参照步骤12〜13 进行体外转染实验；体内转染实验，请 参 照 步 骤 14〜15。

体外基因转染

12.进行体外转染实验之前，在 24 孔板中用含有 1 0 % 胎牛血清的完全培养基培养哺乳动物细胞过夜，如 C V -I 细胞，以每孔 I X l O 5 个细胞的密度种植。

13•更换培养基，在孔中加人包封了 ZfjtgD N A 的 N L P ，培养 4〜48 h (期间培养基可以更换也可以不更换)。用适当的方法检测细胞合成的相应蛋白质。

对 于 s i R N A 或者反义寡核苷酸样品，用包封了对照序列的 N L P 作对照，分析基因敲出的效率。

体内基因转染

14•从小鼠的尾静脉注射小体积（约 2 0 0 ul ) 包 封 1 0 〜 50ug D N A 或其他寡核苷酸的 N L P 。

15•在合适的时间（如 24 h 或者 48 h ) , 将动物处死，用适当的方法检测靶组织中的基因转染效率。

例 如 ，检测不同器官中萤光素酶基因的转染：

丨. 处死动物，取 出 器 官 （如肝脏、脾 脏 、肺或心脏)，用冷的磷酸盐缓冲液进行清洗。

丨丨•切取并转移 200m g 组 织 ，置 于 含 Ig Zircon Beads (直 径 2. 4 mm ， Biospec 产品）和 ImlIX Reporter 裂 解 缓 冲 液 （Promega) 的离心管中。

iii•用 Mini-Beadbeater (Biospec 产品） 以 5000 beating rate/m in 下勻桨 30s 捣碎组织。

iV•离心样品，取 IOul上清，加 人 100ul 萤光素酶检测溶液，依试剂盒说明来检测活力。