质粒 DNA 大量制备实验

DNA 实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

用碱和SDS处理可以大规模的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl- 溴化乙锭梯度离心进一步纯化。了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用；掌握质粒DNA分离和纯化的原理；学习碱裂解法和煮沸法分离质粒DNA的方法。

来源：丁香实验

操作方法

碱裂解法

1. 往2 ml 烧瓶中加入500 ml ，含有适当抗生素的LB培养基，然后加入5 ml 过夜培养的。2. 带有所需质粒的大肠杆菌培养物，再于37℃培养至饱和状态（OD600≈4）。 3. 于4℃，6 000 g 离心10 min，用4 ml GTE。 4. 溶液重悬沉淀，并转移到一个容积≥20 ml 的高速离心管中。（细菌沉淀可以在-20℃或-70℃无限期保存。） 5. 加入1 ml 新配

平衡离心法

1. 粗裂解物制备方案最后一步得到的沉淀溶于4 ml TE缓冲液中，加入4.4 g CsCl，溶解后，再加入0.4 ml 10 mg/ml 溴化乙锭。 2. 将溶液转入一个5 ml 的quick-seal快速封口的超离心管中。 3. 酌情往管中加入CsCl/TE溶液，封好离心管。 4. 于20℃，500 000 g离心 3.5 h或于20 ℃，以350 000 g 离心14 h 以上。