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碱裂解法

相关实验:质粒 DNA 大量制备实验

最新修订时间:

原理

这一方案科能是最常用的质粒制备方法,该法不仅相当决捷可靠,而且可获得相当纯净的粗制DNA。

材料与仪器

大肠杆菌
葡萄糖 Tris EDTA TE NaOH SDS 异丙醇 乙醇 乙酸甲
离心机 漩涡混合器 水浴锅

步骤

1.  往2 ml 烧瓶中加入500 ml ,含有适当抗生素的LB培养基,然后加入5 ml 过夜培养的。

2.  带有所需质粒的大肠杆菌培养物,再于37℃培养至饱和状态(OD600≈4)。
 
3.  于4℃,6 000 g 离心10 min,用4 ml GTE。

4.  溶液重悬沉淀,并转移到一个容积≥20 ml  的高速离心管中。(细菌沉淀可以在-20℃或-70℃无限期保存。)
 
5.  加入1 ml 新配的含25 mg/ml 溶菌酶的GTE溶液,重悬沉淀,于室温放置10 min。
 
6.  加入10 ml 新配的NaOH/SDS溶液,并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠。于冰上放置10 min。
 
7.  加入7.5 ml 乙酸钾溶液,用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀,于冰上放置 10 min。
 
8.  于4℃,20 000 g 离心10 min 将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中,如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤。

9.  加入0.6倍体积的异丙醇,颠倒混匀,室溫放置5~10 min。

10.  于室温1500 g 离心10 min。
 
11.  加入2 ml 70%乙酵轻轻洗涤沉淀,然后短暂快速离心,吸去乙醇,并真空干燥。
 
12.  沉淀可以在4℃无限期保存。

来源:丁香实验

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