原理
这种方法可以得到除去了大多数杂质的高纯度质粒DNA。但它需要使用溴化乙锭,并且需要长时间的超速离心来形成密度梯度。
材料与仪器
DNA
TE 氯化铯 溴化乙锭 NaCl 乙醇
离心机 平衡住
TE 氯化铯 溴化乙锭 NaCl 乙醇
离心机 平衡住
步骤
1. 粗裂解物制备方案最后一步得到的沉淀溶于4 ml TE缓冲液中,加入4.4 g CsCl,溶解后,再加入0.4 ml 10 mg/ml 溴化乙锭。
2. 将溶液转入一个5 ml 的quick-seal快速封口的超离心管中。
3. 酌情往管中加入CsCl/TE溶液,封好离心管。
4. 于20℃,500 000 g离心 3.5 h或于20 ℃,以350 000 g 离心14 h 以上。
3. 酌情往管中加入CsCl/TE溶液,封好离心管。
4. 于20℃,500 000 g离心 3.5 h或于20 ℃,以350 000 g 离心14 h 以上。
5. 首先从管的顶端描入一支针头,然后用带另一 20G针头的3 ml 注射器将质粒带吸出。
6. 进行第二次超速离心,除去混杂的RNA和染色体DNA以获得更高纯度的质粒。
7. 按质粒溶液的1.5~2倍体积装Dowex AG50W-X8柱子,用数倍体积的TE/0.2 ml NaCl溶液清洙和平衡柱子。
8. 用注射器将混合有溴化乙锭的质粒DNA溶液直接加到树脂的顶部,注意不要摇动树脂。
8. 用注射器将混合有溴化乙锭的质粒DNA溶液直接加到树脂的顶部,注意不要摇动树脂。
9. 立即收集流出液,然后用2倍于上样体积的TE/0.2 ml NaCl溶液洗脱柱子两次。
10. 加入2倍体积乙醇于室温或-20℃沉淀质粒DNA,于4℃,以10 000 g 离心 10 min。
11. 沉淀用70%乙醉洗涤1遍,真空干燥,溶解于TE缓冲液,并于4 ℃保存。
注意事项
一、溴化乙锭是一种诱变剂并能造成环境污染,操作时应戴手套,并且妥善处理。
二、为了防止紫外线对眼睛的严重拫伤,应戴紫外防护眼镜或面罩。
二、为了防止紫外线对眼睛的严重拫伤,应戴紫外防护眼镜或面罩。
来源:丁香实验