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胰腺提取组织蛋白没有内参

相关实验:利用植物蛋白质芯片研究蛋白磷酸化实验

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魅上帝123

大鼠的胰腺组织提取蛋白,按RIPA:PMSF:磷酸酶抑制剂=100:1:1比例提取,部分蛋白没有内参,如何更有效解决,请教各位大佬

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4 个回答

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sswei

有帮助

1.转模板不平整,在内参的位置结合不紧密,导致内参蛋白没有完全转到膜上,可换平整的板试一试;2.抗体结合力较差,换个批次或者公司的试剂试一试;3.转膜时间不够或者过长,导致内参蛋白没能完全转到膜上或者转出膜外,调整时间试一试

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汤姆卜丽波

有帮助

你蛋白样本有没有加蛋白酶抑制剂?怎么保存的?保存了多久?上样是多少ug?一般来说只要上样1ug蛋白就能看到很明显的内参条带,假如蛋白有问题你是啥条带都看不到的。


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loveliufudan

有帮助

可以从以下几个方面优化:

1. 调整裂解液配比,适当增大RIPA液用量,加强裂解强度。

2. 裂解过程中充分涡旋和反复提吸,帮助组织充分裂解。可以使用组织均质器增加效果。

3. 4°C条件下裂解,降低蛋白酶活性,防止蛋白降解。

4. 提高PMSF用量,例如提高到1mM,加强抑制蛋白酶。

5. 增加蛋白酶抑制剂种类,如E-64、青霉素等广谱蛋白酶抑制剂。

6. 裂解后高速冷却 centrifugation去除不溶物质。

7. 检查内参抗体的适用性,可试用GAPDH、β-actin等常用内参抗体。

8. 定量全蛋白,保证各样品上样总蛋白量一致。

9. 尝试不同的裂解液,找到最适合该样品的配方。

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huarenqiang5

有帮助

可能是你提取的过程有问题,可以用液氮研磨的方法快速裂解组织。

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