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RIPA缓冲液中剪碎组织后,转移到匀浆器中,
加足5ml RIPA缓冲液,研磨20min.
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蛋白浓度低可能是原始细胞不足,可以多加一些细胞,然后适当延长裂解时间
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可以按以下几点操作进行:
1. 按需处理细胞。
2. 平板用 PBS 洗涤,以去除残留的培养基。
3. 每个 10 cm 的培养皿添加 400 µl 1x RIPA 缓冲液。
4. 平板放在冰上孵育 5 分钟。
5. 刮取细胞。
6. 超声短暂处理。
7. 提取物用冷微量离心机以 14,000 x g 的离心力离心分离 10 分钟。
8. 取上清液后使用。
9. 对于非黏附细胞,用 1X PBS 洗涤并进行沉淀后,每 107 个细胞添加 400 µl 缓冲液。
10. 1X RIPA Buffer 可用于裂解组织样品,尽管在添加裂解缓冲液后建议进入均化步骤。按照 100 mg 组织对应 1 ml 缓冲液的比例提取组织。组织提取物还需进行超声处理。
11. 其他蛋白酶抑制剂可添加到 1x 裂解缓冲液中。
12. 试剂抵达时,该缓冲液中可能会发生聚沉,因为提供的 10X 配制液中包含高浓度的试剂。有时,即便加热到室温,也会持续聚沉。我们建议将缓冲液加热到 37°C 15 分钟后混合,以消除沉淀。或用 ddH2O 将 10X RIPA 稀释为至少 5X 的溶液,以便获得不含沉淀物的溶液。一旦稀释,可进行分装并保存在 -20°C 下供日后使用。
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以下是一些可能的改进策略:
1. 增加细胞数量:如果可能,尝试增加用于提取的细胞数量。更多的细胞通常会导致更高的蛋白浓度。
2. 优化裂解条件:确保充分裂解细胞。这可能包括更长时间的震荡或孵育,使用超声波处理,或增加裂解缓冲液的体积。
3. 使用蛋白酶抑制剂:在裂解缓冲液中添加鲜制的蛋白酶抑制剂,以防止蛋白质被分解。
4. 避免蛋白质沉淀:在离心和吸取上清液的过程中,小心操作以避免损失可能的蛋白质沉淀。
5. 选择更强力的裂解缓冲液:如果以上方法都不能提高蛋白浓度,可以尝试更强力的裂解缓冲液,如SDS裂解缓冲液。但请注意,这种强力的裂解缓冲液可能不适用于所有类型的后续实验,如免疫沉淀。
6. 蛋白浓缩:如果蛋白质浓度依然低,但又需要更高的蛋白浓度进行后续实验,可以考虑使用蛋白浓缩工具,如离心浓缩器或蛋白沉淀剂,来增加蛋白浓度。