求助平滑肌细胞transwell迁移实验

最近在做transwell迁移实验，但是最后显微镜拍照时，有时整个视野有细胞，有时只有某一个角落有细胞，有时完全没有细胞。不知道是哪一步出了问题，或者哪些步骤需要更注意。做了好久还是没出结果。

所以特向园子里各位大佬请教🌷🌷

以下是实验步骤：

1.Transwell上室接种1×105个/孔的细胞(200ul).下室加700ul含10%FBS的培养基

2.向下室加入诱导因子，药物（已知可抑制迁移）以相同浓度加在上下室

3. 37℃ 5%CO2培养箱培养24h

4.36h后，将迁移小室取出，弃培养基，用PBS洗2次（烧杯内洗.动作要轻）

5.向下室加入700ul.上室300ul 4%PFA 固定细胞30min(室温)

6.去除PFA并用PBS清洗2次.稍风干（大概5min）

7. 用0.1%结晶紫染液染色15min. （上下室都加）

8.染色结束后用PBS洗2次，湿棉签小心拭去上室未迁移的细胞，晾干

9. Leica显微镜拍照.随机选取5个独立视野拍照并统计(10×).(20×)