求助！普通离心方式分离酵母细胞壁和细胞内容物

酵母细胞壁和细胞内容物的分离可以通过差速离心实现。以下是一种可能的实验流程，供参考：

将破碎后的酵母细胞悬液转移到离心管中。

对悬液进行低速离心（例如1000g，5分钟）去除酵母细胞碎片和细胞壁残留物，得到上清液。

取出上清液，进行高速离心（例如12,000g，15分钟）以沉淀酵母细胞壁。

将酵母细胞壁沉淀洗涤并重悬于缓冲液中，用于后续的实验。

将上清液转移至新的离心管中，进行更高速的离心（例如30,000g，30分钟）以沉淀酵母细胞内部组分。

取出上清液，可进行进一步纯化和分析。

这个方法可以在一定程度上分离酵母细胞壁和细胞内容物，但并不能完全去除它们之间的交叉污染。因此，在进行实验时需要进行一定的控制和验证。

参考文献：

Kupiec M, Byers B, Esposito RE, Mitchell AP. Meiosis and sporulation in Saccharomyces cerevisiae. Cold Spring Harbor laboratory press, 1997.

Varela JA, Macedo AJ, Nunes F, et al. Production of cell wall mannoproteins during exponential growth phase by Saccharomyces cerevisiae cells[J]. Journal of Applied Microbiology, 2009, 107(6): 2040-2047.

离心步骤：

1.将酵母菌接种于YPD培养基（100 ml 到20 L），剧烈摇动或强制通气条件下培养至对数中期（OD600≈1~5）。培养物在预称重的离心瓶中于4℃， 1 500 g 离心5 min。

2. 确定酵母细胞的湿重，它与压紧的细胞体积大致相同。在所有的后续步骤中菌体的量将当作1体积来考虑。

3. 细胞用2~4体积冰水重悬，并立即于4℃，1 500 g 离心5 min，加入1体积含30 mmol/l DTT的酵母消解酶缓冲液重悬细胞、室温放置15 min。

4. 于4℃，1 500 g 离心5 min，菌体用3体积的酵母消解酶缓冲液重悬。

5. 在每毫升原压紧细胞中加入2 mg（200 U）酵母消解酶-100T，于30℃水平摇床以大约50 r/min 的转速温育40 min，通过水渗破法确定菌体是否完全转变为原生质体，如果原生质体化不完全，应继续温育直到完全。

6. 1 500 g 离心原生质体5 min，小心弃上清，原生质体球沉淀块不如细胞沉淀块般紧密。

7. 用2体积冰冷的酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，原生质体1 500 g 离心5 min，重复2次。

8. 用0.5体积的细胞核缓冲液重悬细胞。

9. 将细胞悬液逐滴加入盛有15~25体积冰冷的Ficoll缓冲液的烧杯中，此过程在冰浴或冷室中进行，不断地振荡。

10. 将悬浮液转移到离心管中，于4℃，3 000 g 离心5 min，如果要完全除去细胞碎片， 重复离心几次。

11. 将上清转移至一个新的离心管中，于4℃12 000 g 离心20 min，沉淀用5~10倍体积的细胞核缓冲液重悬；再于4℃，12 000 g 离心。