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新手重组质粒单酶切多条带,求求大神们帮忙解答,感谢感谢

相关实验:质粒的酵母直接转化

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nmnl

pet28a和目的基因都分别都进行EcoRl和Xhol1单酶切,双酶切,37度.4小时,检测图1如下,然后过夜T4连接酶连接过夜,转入Dh5a,做PCR菌液单酶切和双酶切图2,发现1号单酶切EcoRl出现4条带,2号Xhol1出现2条带和3-7号双酶切条带一样,单酶切和双酶切最下面一条带和目的基因一样大小都在400左右,但测序结果正常。不知道原因在哪里呢?

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3 个回答

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loveliufudan

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根据你提供的信息,可能有几种原因导致PCR扩增产物的带状图谱和酶切结果不完全匹配,具体如下:

PCR扩增产物的带状图谱中的条带可能来自多个目的基因的不同片段,或者有一些非特异性扩增产物,这可能是PCR反应条件优化不当导致的。可以尝试进行PCR条件优化,如改变退火温度、延长延伸时间、调整引物浓度等,以提高PCR产物的特异性和纯度。

酶切反应中,如果消化时间、酶的浓度和活性不足,可能导致目的基因未被完全消化或出现部分消化的产物。你可以尝试增加酶的浓度或者延长酶切时间,以确保完全消化。

双酶切可能存在酶切位点相互影响导致不同的酶切结果。在进行双酶切之前,需要仔细检查两个酶的酶切位点,以确保它们不会相互影响。如果有影响,可以考虑使用单酶切或者其他酶进行消化。

最后,如果测序结果证明PCR产物是正确的,那么PCR扩增产物的带状图谱和酶切结果不完全匹配的可能性也可以是减少PCR产物的带状图谱,提高PCR产物的纯度,或者重新进行酶切反应,以确保完全消化目的基因。

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bamboopiggy

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没看到你的图,但是感觉是你的酶切过度了尤其是EcoRI有星号活性的,如果测序正确,可以用的。

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土井挞克树

有帮助

考虑酶切不是特异性的切割酶,或者存在重复序列。

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