无缝克隆不长菌怎么办？救救孩子吧做了一个多月了
茜茜008
载体大小12165bp（由1553bp、675bp、1414bp、5005bp、3628bp组成；重叠区域为20bp-25bp）
（PS：均使用高保真酶P，其中5005bp+3628bp是我的原始载体）
无缝克隆试剂盒：全式金pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly
用过的感受态细胞：DH5a、stbl3、Trans-T1 平板上都不长菌 害
转化体系：50ul感受态+2ul无缝克隆产物后冰浴30min；严格热激90s后冰浴2min；37℃ 活化1h；平板氨苄100ug/mL；涂布100ul；
问题1：无缝克隆的DNA产物各连接处PCR鉴定胶回收后测序正确（800bp左右），我这样做能证明我的无缝克隆结果是已经成环了的吗？（因为PCR有级联放大的作用）
问题2：空载质粒（8608 bp）能长，长出来的单克隆挺多的，是因为我所构建质粒太大吗？还是因为我无缝克隆有没连上的地方？
问题3：是否存在其他的方法可以在转化之前对我的无缝克隆产物是否成环进行鉴定？
想知道更多细节可以疯狂问我！！！
5 个回答
dxy_uub9llbw
In-fusion反应液可以直接用引物PCR，可以加点cloning enhancer
bamboopiggy
1.你是把pcr后的产物直接进行测序了？那只能说明你pcr没有问题，不能说明已经连接成功。除非是你连接以后的产物，跨接头pcr测序正确，才能说明已经成环。
2.你构建的质粒确实有点大，你转化的时候，为什么不把连接产物全部转化了？而只加了2ul？建议你把连接产物全部加到50ul的感受态里面，进行转化。
3.如果你长出菌落来，你可以考虑菌落pcr试试，如果跨接头测序正确，说明已经成环。
迟C迟
可能是你连接的片段太大了，连接效率不高，可以换个试剂盒试试，说不定就连上了。
天一湖医者
1.培养基的问题。用确定可以长起来得菌测试一下，可以很快知道是否有问题。
2.确认抗性是否正确。
3.最可能的问题是连接转化失败，这个问题也最难解决，涉及的小问题更多。先确认试验设计没有问题，再确认酶切是否有问题，然后再确认连接过程是否符合规定。
4.如果确认上述问题都没有，那就是另一个问题：克隆的产物对转化菌种有毒性，导致正确的克隆都死了。解决方法：换菌种试试或使用特殊培养基。
未来9
可能原因：
- 1、转化失败
- 2、涂错抗性板
- 3、无缝克隆试剂盒不好使了
- 4、没组装上，检查下同源臂的overlap正不正确，够不够长，25bp最好。
- 5、扩增无缝片段使引物应使用PAGE等较好的纯化方式。
