无缝克隆不长菌怎么办？救救孩子吧做了一个多月了

In-fusion反应液可以直接用引物PCR，可以加点cloning enhancer

1.你是把pcr后的产物直接进行测序了？那只能说明你pcr没有问题，不能说明已经连接成功。除非是你连接以后的产物，跨接头pcr测序正确，才能说明已经成环。

2.你构建的质粒确实有点大，你转化的时候，为什么不把连接产物全部转化了？而只加了2ul？建议你把连接产物全部加到50ul的感受态里面，进行转化。

3.如果你长出菌落来，你可以考虑菌落pcr试试，如果跨接头测序正确，说明已经成环。

可能是你连接的片段太大了，连接效率不高，可以换个试剂盒试试，说不定就连上了。

1.培养基的问题。用确定可以长起来得菌测试一下，可以很快知道是否有问题。

2.确认抗性是否正确。

3.最可能的问题是连接转化失败，这个问题也最难解决，涉及的小问题更多。先确认试验设计没有问题，再确认酶切是否有问题，然后再确认连接过程是否符合规定。

4.如果确认上述问题都没有，那就是另一个问题：克隆的产物对转化菌种有毒性，导致正确的克隆都死了。解决方法：换菌种试试或使用特殊培养基。

可能原因：

1. 1、转化失败
2. 2、涂错抗性板
3. 3、无缝克隆试剂盒不好使了
4. 4、没组装上，检查下同源臂的overlap正不正确，够不够长，25bp最好。
5. 5、扩增无缝片段使引物应使用PAGE等较好的纯化方式。