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传代细胞培养,胰酶消化总是把握不好时间,时间长了细胞碎片增多,细胞成片脱落活性不好;时间短了消化不足则细胞从瓶壁上吹不下来。有什么好的方法来把控?
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我们一般是干消 然后计时一分钟 从培养箱取出到倒置显微镜下看看,如果都脱离底壁就进行下一步 如果还有一部分细胞贴壁 就放培养箱再过30秒 再观察
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胰酶消化时间得根据你的细胞特点来定,一般控制在1-3分钟左右,你可以每隔一分钟吹打试一下。
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贴壁干细胞酶消化传代时通常采用两种方式:1)、加入胰酶等干细胞脱落后,再加培养基中止胰酶作用,离心传代;2)、加入胰酶后,镜下观察待干细胞开始脱落时,弃去胰酶,加入培养液并分瓶。但前者太麻烦,而后者有可能对干细胞施加胰酶选择,因为总是贴壁不牢的干细胞先脱落。
常用的消化酶有:
1)、胰酶 这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据干细胞种类、作用温度等因素而变化很大,从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的干细胞,在37度条件下,一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于干细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液,否则影响活性。保存于-20度。
2)、胶原酶 这种方法比较少,一般是用原代培养时,从组织消化下干细胞。这种方法作用温和,对干细胞损伤较小,但是,价格也较贵。中止同样是用血清。
胰酶的质量是影响干细胞的消化的关键因素之一,如果配的比较标准,消化的时候就容易消化,反之就不易消化。还要在你看到消化过头的情况下,如果干细胞下来的比较多了,这时可以连同cmf或pbs加上营养液一起传。营养液中有血清,胰酶遇到血清就会自动终止消化,但这样操作对干细胞是有一定的影响的。
对于容易消化的干细胞,加入pbs缓冲液洗去血清或加入胰酶,先中和血清的作用(30s),弃之,再加入适量胰酶作用10s-40s(根据细胞消化的难易程度),弃之,这样依赖残余的胰酶就可将干细胞消化单细胞
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如果是新购买的细胞,可以先用低浓度的胰酶摸索一下消化时间,每隔一分钟观察细胞是否变圆,做好记录。总之,在收获细胞培养瓶内的细胞时一定要控制好胰酶消化时间,这样才能很好的保持细胞的活性。
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在不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37时,胰酶溶液的作用能力比较强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
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在镜下看,如果细胞缩了,爪爪变短了,就可以了。
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贴壁细胞6ml完全培养基中止消化,消化时间为1-5min,具体以细胞而议,采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面,注意吹打全部培养表面,可以按照先左右吹打,后上下吹打的方式。
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