荧光素钠测定血脑屏障通透性

血脑屏障细胞的生长

1. 使用12 孔板，请将细胞包被液种到孔里。

2. 将板和每个刀片解压在生物安全柜中，并在那里执行进一步步骤。使用消毒钳抓住刀片在其宽基上移动它。

3. 用90μL的10微克/mL胶原蛋白IV和10μg/mL纤维蛋白混合物覆盖每个刀片的多孔膜。之后放入细胞培养箱中孵育24小时，在37°C下孵化。

4. 将 1 mL 的 1x PBS 移入每个刀片，然后用真空泵吸出溶液，用于细胞培养，将刀片洗涤两次。

注意：若使用cell systems细胞包被液，前三的步骤为：使用移液管将包被液移入孔板里，静等2分钟后吸出，无需清洗，直接执行第四步。

5. 通过在上部移液 0.5 mL 的预热 cell systems经典细胞培养基和下腔室的 1.5 mL 来平衡膜。在具有5%CO2大气的细胞培养箱中，在37°C下孵育30分钟

6. 种子2 x 105人类微血管内皮细胞进入每个上腔，并在细胞培养箱中以37°C孵育12孔板。

7. 使用真空泵从细胞培养液中吸出培养基，然后通过移液 10 mL 的 1x PBS 清洗单层，然后用真空泵对溶液进行吸气。

8. 将5ml的培养基吸出培养瓶，用1x浓缩胰蛋白酶-EDTA完全覆盖细胞。在细胞培养箱中37°C下孵育烧瓶3-5分钟。

注：如果细胞未分离，请轻拍培养瓶让细胞脱落。

9. 加含有血清的培养基中和

10. .在 210 x g下将悬浮液离心 3 分钟，用真空泵去除上清液，用移液器将细胞重新悬浮在 5 mL 的培养基。

11. 将细胞悬浮液的10μL与10μL的0.4%台盼染色剂混合在1.5 mL微管中，使用细胞计数器。将10μL的混合物加入计数室滑块，放入细胞计数器，然后开始计数。

12. .将计数器聚焦在单元格上，使其边缘为深蓝色和中间白色。之后，启动适当的细胞计数程序。

13.要计算每个刀片的体积，请将每刀片获得的 2 x 10^5个单元格的细胞悬浮液的计算浓度分开。

这个你得做wb和免疫荧光法检测通透性。