非变性蛋白电泳，植物总蛋白怎么提取呀？

一、植物组织蛋白质提取方法
1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液，样品制备完成。
蛋白质提取液：300ml
1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml
2、甘油（Glycerol）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g

氯醋酸—丙酮沉淀法

1 、在液氮中研磨叶片

2、 加入样品体积3倍的提取液在-20 C的条件下过夜，然后离心（4 C 8000rpm以上1 小时）弃上清。

3、 加入等体积的冰浴丙酮（含 0.07%的3 -巯基乙醇），摇匀后离心（4C 8000rpm 以上 1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。

4、 上样前加入裂解液， 室温放置 30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中， 然后离心 （15C

8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在 4 C待用。

5、 用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入 -80 C备用。

药品：提取液：含10%TCA和0.07%的3 -巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为 5ml），使用前再加入 1M的DTT65ul/ml。

非变性蛋白电泳，植物总蛋白提取

1. TCA-丙酮法

（1）称量一定量的样品置于液氮预冷的研钵中，加少许PVPP，反复加液氮研磨至粉末。

（2）研磨好的样品用10 倍体积（w/V）的10%的TCA-丙酮溶液悬浮，加入0.1 M PMSF、1 M DTT 至终浓度为1 mM PMSF、10mM DTT，超声5 分钟，于-20℃静置6 小时或过夜后，4℃，20000g 离心15 分钟，弃上清。

（3）沉淀用10 倍体积于样品的丙酮溶液重悬浮，于-20℃静置1 小时后，4℃，20000g 离心15 分钟，弃上清。

（4）重复步骤（3）一次。

（5）沉淀用10 倍体积于样品的乙醇/乙醚=1:1 洗，于-20℃静置1 小时后，4℃，20000g 离心15 分钟，弃上清。

（6）重复步骤（3）一次。

（7）取出沉淀真空干燥约5 分钟，除尽有机溶剂。

（8）按10mg 干粉末加200 微升裂解液的比例，加入1 mM PMSF、10mM DTT，超声5分钟，充分溶解1 小时，10℃，35000g 离心30 分钟，上清为所需的蛋白溶液。

（9）用Bradford 法测定蛋白样品的蛋白浓度。

（10）蛋白样品溶液小量分装，-80℃保存。