有做THP-1巨噬细胞M2极化成功的吗？

建议添加pma，可以提高极化成功率

可以按以下步骤进行：

1、THP-1-M0 巨噬细胞分化 将THP-1 细胞按1×106～2×106个/mL 密度接种于完全培养基中，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，每2～3 d 换液。分别用50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L PMA 刺激THP-1 细胞48 h，诱导转化为M0型巨噬细胞，每组设置3个复孔，倒置相差显微镜下观察THP-1细胞形态，筛选PMA的最佳刺激浓度。

2、细胞因子诱导THP-1-M0 向M1 型和M2 型极化 PMA刺激后，用RPMI-1640完全培养基培养细胞24 h，加入10 pg/mL LPS 和20 ng/mL IFN-γ 处理72 h，使M0 向类M1 型细胞方向极化，得到THP-1-M1；加 入20 ng/mL IL-4 和20 ng/mL IL-13处理THP-1-M0 使其向类M2 型方向极化，得到THP-1-M2。

3、取对数生长期的细胞以适当密度接种于T25 细胞培养瓶中，待细胞完全贴壁后，换新鲜的完全培养基继续培养48 h，细胞汇合度达到80%时收集培养上清液，用0.22 μm 孔径的细胞滤器过滤细胞碎片，4 ℃、3 000 r/min 离心5 min，取上清。按1∶1 体积比加入新鲜完全培养基，分别配置5-8F 和HONE1 细胞的条件培养基，加入THP-1 源M0 细胞中，处理48 h，以不作处理的M0 细胞作为阴性对照组，实验组为5-8F-M0及HONE1-M0。用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测多个标记物表达，分析THP-1来源的巨噬细胞极化方向。

4、流式细胞术检测巨噬细胞CD14、CD68、CD86、CD163、CD206表达 胞外流式抗体的检测：PBS冲洗，消化细胞，25 ℃、1 000 r/min 离心5 min，弃上清，用细胞染色缓冲液重悬细胞，制成终浓度为1×106～10×106个/mL 的细胞悬液，加入抗体，室温避光孵育30 min，染色缓冲液洗涤、重悬细胞，过滤后上机检测。

THP-1是一种人类单核细胞系，可以通过化学诱导方式使其分化成巨噬细胞。M2极化是一种特定类型的巨噬细胞激活状态，可以通过添加特定的生长因子和细胞因子来实现。以下是一个可能适用于您的实验的M2极化方案：

THP-1细胞培养和分化：

将THP-1细胞在完整的RPMI 1640培养基中培养至细胞密度为2x10^5/ml。

将12-Phorbol-13-myristate acetate（PMA）加入到细胞培养基中，最终浓度为50ng/ml，然后培养细胞48小时，直至细胞扩增至适当密度。

M2极化：

用完整的RPMI 1640培养基洗涤细胞，并将其在无血清RPMI 1640培养基中培养24小时。

加入人类IL-4和IL-13，最终浓度分别为20ng/ml，然后继续培养24-48小时。

收集细胞，进行流式细胞分析或Western blot等实验。

注意事项：

实验前请确定使用的抗体已经充分验证并在文献中得到验证。

在整个实验过程中，请保持细胞在恒定的体外条件下。

不同的细胞系可能对不同的生长因子和细胞因子有不同的反应，因此最好进行多次实验并根据实验结果进行优化。