Perforin

可以用流式做胞内染色，第一步要固定细胞，一般采用多聚甲醛，使细胞固定在一定的形状，即使细胞膜破裂细胞也能保持在这个形状而不发生碎裂：第二步，需要用打孔剂在细胞膜上打孔，同时加入荧光素偶联抗体，使抗体能够通过细胞膜上人为的小孔进入细胞内部与细胞因子结合。在此之前需利用高尔基体阻断剂（brefeldinA,BFA）阻断细胞因子的分泌，而不影响细胞因子的合成，让细胞内细胞因子的含量达到流式检测的标准。

具体步骤方法：

(1)将不同处理组的样品细胞置于培养板中，加入适当的培养基和各种处理，置于孵箱中（37℃，5%的CO2）培养。

(2)在培养结束前6h，加入BFA，仍将细胞置于孵箱中，使新合成的细胞因子储存于细胞内。

(3)收集培养板中的样品细胞，用PBS洗涤一次，取适量细胞重悬于0.5mlEppendorf管中。

(4)将需要标记的荧光素偶联抗体加入样品细胞悬液中，充分混匀，4℃静置30min。

(5)PBS洗涤一次，洗去游离的未标记上的抗体。用细胞固定剂（200µl的多聚甲醛）重悬细胞，室温静置20min，充分固定细胞。

(6)加入等量（200µl）的打孔剂，充分混匀，离心一次，弃上清。

(7)用适量（20-50µl)的打孔剂重悬沉淀，然后加入需要检测的细胞因子的荧光素偶联抗体，充分昆匀，4℃静置70min，边打孔边标记。

(8)PBS洗涤一次，洗去游离的抗体。用200µl的流式PBS重悬沉淀，将样品细胞置于流式管中，即可上样分析。

肯定是需要破膜才行。因为perforin穿孔素的作用是在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道，导致靶细胞溶解破坏。穿孔素形成的孔还可以使颗粒酶进入靶细胞，引起靶细胞凋亡。具体步骤你可以看看这篇文献”ESCRT-mediated membrane repair protects tumor-derived cells against T cell attack ”