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    用流式细胞仪检测细胞因子的分泌和分离 分泌细胞因子的细胞

    相关实验：用流式细胞仪检测细胞因子的分泌和分离分泌细胞因子的细胞

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    基本方案细胞因子分泌实验

    材 料

    冰冷的或 37°C 预温的培养液。例如，培养人细胞用含 1 0 % 人 A B 血浆或自身血清的 1640 完全培养液。培养小鼠细胞用含 1 0 % 小鼠血清的 R P M 1-1640 完全培养基

    抗原， 1〜10ug/m l 肽 或 1〜100ug/m l 蛋白质

    合适的对照抗原

    金黄色葡萄球菌肠毒素（S E B ， Sigma)

    P B S ， p H 7. 2 , 含 0.5% (m /V ) B S A 和 2 mmo l /L E D T A ，冰上预冷

    细胞因子捕获试剂：一抗，包含抗细胞表面抗原的抗体（如 C D 4 5 ) 和抗细胞因子抗 体（Miltenyi Biotec 公司）

    重组的细胞因子

    细胞因子检测抗体（Miltenyi Biotec 公司）： P E 、 A P C (allophycocyanin) 或 FITC标记的抗细胞因子单抗

    荧光素标记的抗体：抗 人 或 小 鼠 C D 4-F I T C ，抗 人 C D M -PerCP，抗 小 鼠 C D 45R /B 220- PerCP 等

    抗 P E 磁 珠（Miltenyi Biotec 公司）

    9 6 孔 或 2 4 孔培养板或 6c m 培养皿

    细胞刮或类似工具

    1.5〜15 ml V 形底管或深孔培养板

    慢速旋转培养器

    1 . 制备 人 P B M C (单元 8 . 1 ) 或小鼠脾脏/淋 巴 结 细 胞（单 元 2.1)。计数细胞和测定细胞 活 性

    在 细 胞 分 离 、刺 激 和 冻 存 时 不 要 使 用 任 何 非 人（人 细 胞） 或 非 小 鼠（小 鼠 细 胞 ）
    图 5. 1 0 . 1 细 胞 因 子 分 泌 实 验 示 意 图 。 用 捕 获 试 剂 （抗 细 胞 表 面 分 子 单 抗 和 抗 细 胞 因 子 单 抗 的 结 合 物 ） 将 细 胞 因 子 捕 获 在 细 胞 表 面 ，再 用 标 记 的 特 异 性 抗 细 胞 因 子 抗 体 检 测 捕 获 的 细 胞 因 子 。 免 疫 磁 分 选 大 大 增 加 了 检 测 的 敏 感 性 ， 同 时 可 以 分 离 产 生 细 胞 因 子 的 细 胞 。 的蛋白质，如 B S A 或 F B S 。 2 . 每1乂107个细胞用1〜1〇 1111培养液洗涤细胞， 4°(：， 30(^离心1〇 1^11。 3 . 用培养液悬浮细胞： I X IO7个细胞/m l 和 5 X l O 6个细胞/cm2 ( 例 如 9 6 孔培养板： I X l O 6个细胞/100/xl; 2 4 孔培 养 板 ： I X IO7个细胞/m l ; 6c m 培 养 皿 ： I X IO8个细 胞/l〇ml)。立即进行下一步，或直接将悬浮细胞置37°C ， 5 % 〜7 % C 0 2 培养箱，培 养过夜。 4• 加 入 抗 原 （1〜10ftg/m l 肽 或 1〜100pg/m l 蛋白质），彻底混匀。孵 育 3〜6h (肽） 或 6〜16h (蛋白质）。应设置无抗原或无关抗原的对照。如有需要，可 设 用 lMg/ml 金黄色葡萄球菌肠毒素B 处理的阳性对照，孵 育 3〜16h 。 如果用感染组织来源的抗原，设置一个来源于未感染组织的对照。如果在抗原
    样 品 中 加 了 协 同 刺 激 因 素 （如 lMg/ml 抗 C D 2 8 抗 体 ），必 须 设 置 相 应 刺 激 对 照 。 由 于 细 胞 因 子 仅 在 刺 激 后 短 暂 分 泌 ，所 以 刺 激 后 分 析 的 最 佳 时 间 点 应 通 过 预 实 验 确 定 。 5 . 用细胞刮或类似工具小心收集细胞。 6 . 根据细胞数量，加 I X l O 5〜I X l O 7个细胞到1.5〜15ml V 形底管或深孔培养板。 7•加入 10 倍量冰冷的含 0.5% (m /V ) B S A 和 2m m o l / L E D T A 的 P B S 。 4°C ， 300g 离 心 lOmin。彻底去除上清液。如果洗液不足1 0 倍或上清液不易一次全去除使得洗涤 不完全，可重复洗涤。 8 . 用 100/xl细胞因子捕获试剂悬浮细胞，细胞因子捕获试剂用冰冷的培养液稀释到适 当浓度，常 用 10〜2〇 iug/m l 。彻底混匀。冰中孵育5min。 9 . 可选操作：制 备 “高对照”，吸取少量细胞悬液，加入适量重组细胞因子，终浓度 200〜1000ng/m l 。彻底混匀。冰中孵育lOmin。执 行 步 骤 12。 10 . 根据预期的细胞因子分泌细胞在全部细胞中所占的百分数，用 37°C 预温的培养液将 细胞稀释到适当浓度： < 1 % 〜5 % IX IO6〜2 X I O 6个细胞/ml > 1 % 〜5 % I X IO5〜2 X I O 5个细胞/ml > 2 0 % 〜5 0 % < 1 X IO5个细胞/ml 11. 拧紧试管，置 37°C 孵 育 30〜45min，此期间细胞分泌细胞因子。每 5〜IOmin混匀 细胞一次或用慢速旋转培养器。 1 2 . 加 入 倍 体 积 、冰冷的含 0.5% ( m A O B S A 和 2m m 〇l / L E D T A 的 P B S 。 4°C ， 300g 离 心 lOmin。彻底弃除上清。 1 3 . 用 IOOiUl细胞因子检测抗体和其他荧光标记的标记试剂悬浮细胞，抗体和试剂均用 冰 冷 的 缓 冲 液 稀 释 到 适 当 浓 度 ，常 用 终 浓 度 1 〜 5ag/m l 。彻 底 混 匀 。冰中孵 育 IOmin0 14•加入> 1 0 倍 量 （体积）冰 冷 的 含 0.5% ( m A O B S A 和 2m m o l /L E D T A 的 P B S 。 4°C ， 300g 离 心 lOmin。彻底去除上清液。如果洗液体积不足1 0 倍或上清液不易一 次全去除，导致洗涤不完全，可重复洗涤。 1 5 . 可选操作：根据厂家说明书，免疫磁珠法分离细胞。 1 6 . 加入 SOOiUl 冰冷的含 0. 5 % (m /V ) B S A 和 2m m o l / L E D T A 的 P B S ，悬浮细胞。 4°C 避光保存直到分析。 17. 流式细胞仪分析（第四章）。用 P I或 7-AAD 染色区分活细胞和死细胞。在分析前 立即加入0. 5iiig/ml PI。计 数 200 OOO个细胞以提高灵敏度。

    备 选 方 案 I PBMC 分泌细胞因子的快速检测

    1 . 制 备 和 洗 涤 细 胞（见基本方案，步 骤 1 和 2)。 用培养液悬浮细胞 ： I X l O7 个细胞/m l

    2 . 每个 1.5 ml V 形底管或深孔培养板中加入IOOul含IX IO6 个细胞的细胞悬液。标记为 A

    3 . 按基本方案步骤 4 加入抗原和赙育细胞
    4 . 用 I m l 培养基洗涤细胞，室温， 300g 离 心 5miri。吸去上清液。 5 . 混匀细胞，转 移 20M1细胞悬液到含200M1培养液的第2 管 （孔），标 记 为 B 。阴性对 照不需要B 管 （孔）。 6. A 管 和 B 管 （孔 ） 均加 入 20W 细胞因子捕获试剂（终 浓 度 5〜IOjU g A n D ，混勻。拧 紧试管， 37°C 孵 育 30min。每 5〜IOmin混匀细胞一次或用慢速旋转培养器。 7 . 每 管 （孔）均 加 入 20M1细胞因子检测抗体和其他荧光标记的染色试剂，常用终浓度 1〜5iug/ml。彻底混匀。室温孵育lOmin。 8•加入 Iml 冰冷的含 0 •5 % ( m A O B S A 和 2mmol/L E D T A 的 P B S 。室 温 ， 300g•离 心 5min。去除上清液。 9 . 加 入 500W 冰冷的含0. 5 % (m /V ) B S A 和 2m m o l /L E D T A 的 P B S ，悬浮细胞。流 式 细 胞 仪 分 析 （第四章）。用 P I 或 7-A A D 染色区分活细胞和死细胞。

    备 选 方 案 2 全血细胞分泌细胞因子的快速检测

    附 加 材 料


    ​

    来源：丁香实验

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