肝细胞膜蛋白的免疫组化需要注意点什么呀？

我做的是肝细胞的膜蛋白。最先使用的是二抗试剂盒三步法的，细胞浆总是被非特异染色，细胞膜的染色就更看不清楚了。然后换了两步法的二抗试剂盒，做了第一次（当时没抱什么希望），DAB显色的时候没看具体时间，可能有5分多钟，结果居然做出来了，胞浆很干净，膜上阳性也明显。然后我就想重复再做几次。之后第一次重复的时候我改把抗原修复延长了5分钟，共20分钟，一抗过夜，其他的没变化，DAB染色4分钟的样子，结果做出来胞浆又被染起棕色了。然后第二次重复的时候抗原修复时间又改回了15分钟，一抗过夜，DAB显色还是4分钟的样子（可能比第一次重复的时候要短一点点），这次胞浆非特异染色少，但是我的膜蛋白也没显色了。找不到原因啊！！请做过肝细胞膜蛋白的高手指教！ 关于DAB显色的时间掌握实在拿不准，他们说在显微镜下观看到背景稍变黄就可以了，或者自己的切片上看到一圈一圈的（我觉得在目镜20倍下还是不容易看到一圈一圈的，就看到一片黄的），我都看到整个肝细胞都变得很黄了，但是后面封片后，感觉胞浆那黄色又退却了，非特异背景不深，但胞膜也没显上。望高手指教，我都有点语无伦次了。