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所克的基因的CDs为950bp左右,上下游引物的Tm值为56.4—59.9,用Taq酶克,试了多个温度梯度克不出来,求合适的温度

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dxy_l4vcjkm4


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3 个回答

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龙大人驾到

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Taq DNA酶的活性范围一般介于55-72℃,温度过低、过高都会对酶绒毛发挥作用产生不利影响,因此应选择合适的温度,分子量较大的基因应优先选择较高的温度,而对于950bp左右的基因,选择合适的温度一般应保持在62-65℃,以便获得最佳的PCR扩增效果。

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土井挞克树

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参考温度是57左右,但是建议做预实验梯度温度来验证。

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dxy_l4vcjkm4user-title

您好,我是做了温度梯度,57度的用15的体系没克出来,还有其他办法吗

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loveliufudan

有帮助

对于所需克隆的基因,选择合适的扩增温度需要考虑几个因素:引物Tm值、基因长度和酶的特性。

Tm值是指在给定浓度下,引物与目标片段的一半解离的温度。通常使用引物Tm值作为扩增温度的参考值,但在本案例中,引物Tm值较宽,可能不能提供准确的参考。

因此,建议使用温度梯度来确定最佳扩增温度。这是一种逐渐增加扩增温度的方法,可以检测酶的最佳扩增温度。具体来说,可以使用每5°C的温度梯度从55°C开始测试,逐次升高到65°C,在每个温度处进行扩增,找到可以完成扩增的最低温度即为最佳扩增温度。

值得注意的是,扩增温度越高,扩增效率越高,但是扩增速度越快,可能会导致错误扩增,因此需要在获得最佳扩增效率和最低错误扩增的前提下确定最佳扩增温度。

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dxy_l4vcjkm4user-title

您好,我是从54,55,56度到60.4度,0.2作为温度梯度进行扩增,体系为15的,都没有克出来,是哪里出问题了吗?您这边还有其他的办法吗

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