请问大家有没有遇到过Gibson assembly 乱连的情况啊？
pcr重复不出来
最近在构克隆，把一个6kb和一个4kb的片段1:1用Gibson连接，测序结果不正常，推测应该是6kb的片段自己连了两次。
PCR的产物浓度正常，跑胶条带大小也正常；实验重复过，也试过增加了4kb片段的比例；测序样本也送了十多个，但结果都是一样，显示6kb的自连了两次。
分享
4 个回答
bamboopiggy
有帮助
不仅Gibson，别的酶也有乱连的，只要得到你的目的克隆就可以了。在设计引物的overlap区的时候，注意评分
dxyc42u
有帮助
看你的描述基本没啥问题，看看是不是操作过程有啥问题
loveliufudan
有帮助
Gibson assembly的乱连是因为连接的两个片段中有相似的序列，导致酶在连接的过程中造成了误导性的剪切。
一般来说，减少连接片段中的相似序列，或者在连接的过程中使用更多的酶以减少错误是可以避免乱连的情况的。您也可以考虑采用其他的短片段连接方法，例如In-fusion，以确保您得到正确的结果。
pcr重复不出来
谢谢您的回答！我可以理解相似的序列可能导致错误连接，但是已经送测序的十多个样品全部都是错的；因为明明有可以完全匹配的正确片段不连，却全部都按同一种方式错误连接，我对这一点也比较疑惑
毛利小五郎的徒弟
有帮助
可以使用已知位点的核酸裂解酶裂解后再检测
pcr重复不出来
谢谢您的回答！只是还比较疑惑为什么会出现连接错误的情况
提问
扫一扫
实验小助手
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序