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丁香园张医生
其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG,而切割序列则为中间三角箭头所指的N(N代表任意碱基)。由于N可以是任意碱基,所以如果将切割位置的N设置为T,那么在该酶的切割下,就可以产生一个3’T末端。相似的,在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点(保证切割位点为T即可)就可以产生另一个T末端。一般可以在商业化的T载体基础上进行改造,通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存,使用时用XcmI进行完全酶切(这里的酶切必须保证完全,否则载体易自连,所以XcmI酶最好过量,或者适当延长消化时间),就可以制备得到T载体。
Dr_劉医生
大概率检测出错,检查一下引物设计的序列,建议重新测序一下,
毛利小五郎的徒弟
多一个碱基可能存在重复序列的情况。