实验小白一个，GST pull down应该如何下手？是否有专门的GST标签载体？载体如何构建？

GST载体构建步骤：

一、从目标组织中提取RNA，并反转录形成cDNA序列

二、设计引物

1.打开tair网站，寻找目的基因的CDS序列，并复制序列， 在snapgene中打开；

2.在最终目标载体书中找到多克隆位点，并寻找只在目标载体中，而不在目的基因片段中的两个酶切位点，通过snapgene添加合适的5’—3’两端引物，并在引物上添加所选酶的片段

三、构建中间载体

1.得到引物后，用cDNA序列和引物进行PCR，获得目的基因的片段，构建中间载体

GST的第一步就是构建专门的标签载体，可以直接购买，也可以去载体设计网站进行设计。

进行GST pull-down实验时，你可以按照以下步骤进行：

1. 购买GST标签载体：GST标签通常与质粒载体一起购买。GST标签质粒是经过改造的质粒，其中包含GST基因序列，允许将GST蛋白与目标蛋白相互结合。

2. 构建GST融合蛋白表达质粒：将你感兴趣的目标蛋白的编码序列与GST基因序列连接起来，构建GST融合蛋白表达质粒。这可以通过标准的分子生物学技术，如PCR扩增、限制酶切和连接，或使用基因克隆技术来完成。

3. 将GST融合蛋白表达质粒转化至大肠杆菌（E. coli）等宿主细胞：使用化学方法或电穿孔方法将质粒转化至宿主细胞中。转化后的细胞可以在含有适当选择抗生素的琼脂平板上进行筛选。

4. 培养宿主细胞并诱导GST融合蛋白的表达：在适当的培养条件下，培养转化后的细胞，并添加适当的诱导剂（如IPTG）来诱导GST融合蛋白的表达。

5. 收集并裂解细胞：收集培养的细胞，使用细胞裂解缓冲液使细胞裂解，并释放出GST融合蛋白。

6. 选择亲和层析材料：选择合适的亲和层析材料，例如GST结合树脂（如Glutathione-Sepharose），将其预先平衡。

7. GST pull-down实验：将细胞裂解液与预先平衡的GST结合树脂进行孵育，使GST融合蛋白与树脂结合。随后，通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白，并收集目标蛋白与GST融合蛋白复合物。

8. 分析：通过Western blot、质谱分析等方法检测目标蛋白与GST融合蛋白的相互作用。

关于GST标签载体的获取和构建，你可以购买商业化的GST标签质粒（例如pGEX系列质粒）作为起点。这些质粒已经含有GST基因序列，并提供了适当的限制酶切位点，便于连接你感兴趣的目标蛋白。你可以使用标准的分子生物学技术（如PCR、酶切和连接）来构建GST融合蛋白表达质粒。