求内皮tip cell诱导分化方案

人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 诱导分化为 tip cell 一直未获成功可能是由于多种因素导致的。下面是一些可能的原因：

1.培养条件不当：tip cell 的分化需要较低氧气水平和较高细胞密度。

2.培养基成分不当：tip cell 的分化需要特定的成分如血管内皮生长因子 (VEGF) 。

3.细胞源问题：不同的细胞源可能会对分化结果产生影响。

4.分化方法问题：tip cell 的分化需要特定的分化方式，如分化时间长短，分化过程中细胞培养条件变化等。

建议阅读最新的研究论文，了解最新的研究进展和最佳培养条件，并尝试不同的细胞源和分化方法来试图解决问题。

培养脐静脉内皮细胞时，最好能添加VEGF 或ECGS, 以刺激血管内皮细胞增殖，可增加传代数，获得较多的血管内皮细胞。

按以下步骤进行：

细胞复苏

从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中解冻至管内残留一点冰屑。用75%酒精擦拭冻存管后，将内容物吸至一15ml无菌离心管中，逐滴加入预温至37℃的RPMI-1640培液4－5ml混匀，室温1500rpm离心10分钟弃上清。再用RPMI-1640培液4－5ml洗涤一次，离心后弃上清，加HUVEC完全培养液4－5ml备用，每支HUVEC冻存管含细胞量为5×105个。

细胞接种培养

1、细胞接种：

（1）包被液：用去离水配制0.5%明胶溶液，过滤除菌。

（2）培养瓶包被：取2-4个T25培养瓶，每个培养瓶加2－3ml0.5%明胶溶液，摇匀使包被液布满培养瓶底面，置37℃2小时或放置过夜。

（3）接种细胞：接种前吸净包被液，按2500－5000个细胞/cm接种细胞，每瓶加培养液3-5ml,摇匀后置37℃5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后继续在37℃5%CO2培养箱内培养。

（4）扩大培养：一般每周更换培养液2次，至细胞长至覆盖培养面的70-80%可进行传代或冻存。

消化细胞

消化液：用pH7.0-7.2的PBS或D-Hank’S液，分别配制0.25%胰酶液和0.02%EDTA-Na2液，用前按1：1混合。在细胞传代或冻存前先消化细胞。具体操作如下：吸净培养液，每瓶加消化液1ml，摇匀使其布满培养瓶细胞面。37℃消化2-5分钟。显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部细胞脱落后，每瓶加含10%FBS的RPMI-1640液的中和液4-5ml中和胰酶的消化作用，并用吸管轻轻吹打培养面使细胞完全脱落后，吸至15ml无菌离心管内。4℃1500rpm离心10分钟弃上清，再用中和液洗涤细胞，离心弃上清，加适量RPMI-1640液，混匀后取10ul 细胞悬液加10ul台盼蓝混匀后作细胞计数，按需要做步骤四或五。

细胞传代

细胞冻存

调整细胞数2-5×10个/ml，按含细胞的RPMI-1640液ml数，配制等量的冻存液。冻存液中FBS占80%，DMSO占20%。置细胞悬液于冰浴中，逐滴加入冻存液，边加边摇动。加完后用吸管吹打混匀。于冰浴中分装细胞于冻存管中，1.8ml/管，再将冻存管置于冻存盒内置-80℃冰箱，24小时后转入液氮中保存。