WB为什么这么难做，一时有条带，一时没有

WB其实也是一个很灵敏的蛋白检测技术。蛋白样品提取时产生的偏差会导致条带一时有一时无，尤其时目前大家常用RIPA来进行总蛋白的提取，当目标蛋白处于细胞核，细胞器，细胞膜上，这些蛋白在RIPA提取总蛋白时，细胞核因为裂解的不充分核不破或者是裂解特别大染色质打开样品粘稠核内一些蛋白依然不能释放，细胞器和细胞膜上的蛋白因为是膜蛋白脂质层包裹在RIPA裂解液中溶解度有限，尤其是跨膜蛋白这种问题就更为突出，也就造成了检测的时候一时可以检出一时又不行，如果目标蛋白处于这些位置，可以选择新的总蛋白提取技术，柱式法总蛋白提取，裂解更充分，释放全部蛋白同时又可以去除基因组DNA干扰。

规范化操作，每一次都要按部就班，不要觉得怎么样做，就怎么样做。用的仪器和液体要固定，不要今天借A的，明天借B的

wb本来就是玄学，它虽然简单，但是步骤很多，有一步错误显影结果就不理想。我觉得最主要还是要看转膜和孵抗体这两步吧，这两个步骤一定要做好，就能成功差不多一半。

可能没封闭好，一抗是不是回收次数太多了，二抗不好用。