实验小白者
各位老师,我wb跑PD-L1,说明书分子量是40-50kd,我跑出来是70-100kd,跑了好几次还是这样,请求各位老师帮忙我这个实验小白😫(煮蛋白前加了还原型loading buffer,抗体是CST)
bamboopiggy
你看一下cst说明书里,wb的条带在哪里,其实你只要跑过全膜,确定了你的位置,即使位置和预测的不一样,也是可以的,就是你的这个位置有点寸,咋感觉是你的lysis没有打开到一级结构,还是二聚体的感觉。因为40-50,70-100正好是二倍的感觉
天一湖医者
凝胶与 Marker 等差异导致的轻微偏移。建议根据目的蛋白的大小选择合适的凝胶浓度,并且尽量选择知名厂商的 Marker。
目的蛋白存在翻译后修饰,需要查询数据库及文献资料,了解目的蛋白是否存在翻译后修饰,例如磷酸化、糖基化、泛素化修饰等,这些均可能影响条带的位置。
迟C迟
可能的原因有:
1.胶浓度不对,不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差,可以调整浓度
2.抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度,延长孵育时间
3)酶失活,建议直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
4)目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体,建议查询相关文献确定
5)标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低,建议设置阳性对照比对结果,增加标本上样量