想请问一下大家，检测磷酸化蛋白表达量变化的WB实验，除了加磷酸酶抑制剂之外，怎么操作可以让磷酸化蛋白更好跑出来呢？

因为磷酸化是个可逆过程，所以除了磷酸酶抑制剂，还需要跟时间赛跑，新鲜和短时间流畅的操作会减少磷酸化的变化。当然，抑制剂仍然是关键所在，不过要注意对不同蛋白，磷酸酶抑制剂也不同。

使用5%BSA作为封闭液，增加上样量

磷酸化的蛋白很容易降解的，因此我们要在裂解液配方应该再加入几种磷酸酶抑制剂

还要注意以下几点：1. 收集细胞，裂解细胞时一定要保持低温，温度的影响很重要的。用PBS洗涤细胞时，PBS一定要4度预冷。2. 蛋白一定要妥善保存，最好是收集完成后马上变性并于负80度保存，以保证降解程度最小3：煮好的样品最好分装保存，磷酸基团反复冻溶容易降解！4：电泳buffer等也可以加Na3VO4，如果是组织的话，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前预冷，保持低温的状态