两步法和一步法有何优劣呢？在什么情况下要选择其中一种有没有要求？

其实这个要看你的实验目的，单纯的要跑realtime pcr，一步法，两步法都可以。但是如果想同时拿cdna做别的实验，就用两步法。先得到cdna，再跑realtime。一步法简单，省时间。两步法，稍微复杂，但是也不难做。

一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需构建cDNA文库

两步法RT-PCR首先用反转录酶合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR

一步法比两步法更快速、简便、减少了污染机会、减少了RNA二级结构、减少了PCR反应的错配率；

两步法的优势在于中间产物cDNA，便于保存；且第二步PCR只取逆转录反应产物的1/10进行反应，有利于PCR条件的调整，实验重现性强；

两步法灵敏度比一步法高；但两步法容易产生污染问题；两步法的实验预算要低于一步法。

一步法比两步法更快速、简便、减少了污染机会、减少了RNA二级结构、减少了PCR反应的错配率；

两步法的优势在于中间产物cDNA，便于保存；且第二步PCR只取逆转录反应产物的1/10进行反应，有利于PCR条件的调整，实验重现性强；

两步法可以在第二步PCR反应体系中加入特异性引物，其灵敏度比一步法高；

两步法包括第一链cDNA合成和随后的PCR反应，容易产生污染问题；

两步法的实验预算要低于一步法。