【原创】两步法高分辨溶解曲线（HRM）SNP分型

HRM 是SNP分型的手段之一，其特点为分型费用比较低廉，特别是应用小片段法，鄙人初次应用小片段法对10个SNP成功分型，现将实验的步骤分享，希望能给有需要的同道一点经验，同时希望能多交流，谢谢~~~

两步法HRM不同于一般的HRM法在于PCR和HRM分开做，顾名思义：

第一步：PCR，最好用预混的PCR试剂，我用的是宝生物的PCR Premix TaqTM,便宜又好用。

第二步：HRM,将P好的产物分别加上LC Green及高低温内标，然后加入专用的板，再加矿物油10ul，稍离心，95度变性10min,即可上机分析，15分钟之内分析完。

要想成功地分型，或许还需要注意的几点~~~~

1、片段大小在100bp左右，片段Tm值（注意不是引物的）大概在高低温内标之间，不要靠低温或高温太近；

2、引物特异性好，产生的片段只有目的片段，虽然Blast上有时不能按照你的片段要求设计出引物，或者那里检验的引物特异性很差，但是这还得取决于PCR实验过程的操作和条件的优化。所以大可可以试试自己人工设计的引物或网站是上显示特异性很差的引物；

3、PCR操作过程中尽量避免不必要的失误或不正当的操作，因为只有按照标准操作前提下而P不好的时候才能排除那些干扰因素；

4、PCR的目的片段中只有一个SNP，避免有其他SNP的干扰；

5、P好的产物应尽量上机分析，虽然有-80度冰箱，但个人的体验而言，还是对结果有所干扰。

以上经验仅限于小片段法HRM，如有不正确之处，敬请指教，顺便附上一些图~~~~谢谢！！！

如还有其他经验者，敬请往下写~~~
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