高分辨熔解曲线（HRM ）技术介绍

高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM) 分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。

HRM 原理

HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。

HRM 特点

由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR 基础上增加一个饱和染料。所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。高分辨率熔解曲线分析可以鉴别出PCR 产物中杂合的单碱基突变

这种方法比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。采用这种方法进行的突变的检测不依赖于突变在片段中所在的位置。当片段的大小在400 bp 或者更小时，灵敏性最高。除了能鉴定出未知的杂合突变，高分辨率熔解曲线还可以被用来鉴定特定位点的突变，在这种情况下，扫描未知突变和进行基因分型可以结合在一起，使得分析更为简单。对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。HRM 技术在遗传学研究方面也带来很大便利，只需在PCR 反应体系中加入双链DNA 饱和荧光染料，在PCR 反应之后再花15 分钟，就可以完成96 或384 个样品的DNA 变异扫描。HRM 在这些方面的优势使其具有极强的可操作性，成为近年来国外新兴的遗传学、方法学研究和应用热点。

HRM 技术优势

高通量：1 次可同时检测10-384 样本。

高敏度：HRM 检测灵敏度达1%-0.1% ，是传统“PCR+ 测序”方法25-250 倍。

特异性好：PCR 产物无需后续处理，特异性达100%。

重复性好：用HRM 方法进行分析时，样品经PCR 扩增后直接进行HRM，PCR 产物无需再转入其它分析装置，而直接在同一个PCR 管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染。

操作简便：只需设计PCR 引物，进行PCR 反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限，在Roche LlightCyclerTM 480 荧光定量PCR 仪器上直接获得高分辨率熔解曲线分析，即可完成对样品基因型的判断。

成本低：相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且拓展了其应用面。

适用范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。传统“PCR+测序”方法难以检测大部分不能手术的患者。

其它：只检测PCR 样品中荧光强度的变化，不消耗任何PCR 样品，无污染，PCR 产物可以进行下游分析。HRM 技术不损伤DNA ，分析之后可以直接纯化测序，这使得它非常适合于测序前的SNP 预扫描筛查。

HRM 的应用

1、基因的突变扫描：检测杂合子SNP、区段/碱基缺失、前后重复、杂合子缺失相关研究方向：样本中特定突变位点（SNP）的筛查;疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的扫描，新突变的发现;遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现;植物抗逆性，突变与性状关联性的研究;动植物品质相关多态性位点的研究等。

2、基因组配型：器官移植的HLA 配型、同胞之间HLA 基因型确定应用举例：快速确定HLA 高度多态性位点的类型，及非亲源关系个体间异源造血干细胞移植前的HLA 基因型确认。

3、等位基因频率分析：SNP 频率分析等

4、物种鉴定、品种鉴定：微生物品种、物种快速鉴定；动植物品种鉴定应用举例：临床细菌的鉴定。对临床细菌的培养物进行16SrRNA 的实时扩增，并进行HRM 分析，每个菌种的熔解曲线模式就如果该物种的分子指纹，从而可以根据HRM 的不同对细菌进行鉴定。

5、甲基化研究：甲基化位点的筛查；甲基化程度分析应用举例：用HRM 方法检测MGMT 启动子区域内的甲基化，可检测低达0.1% 的甲基化程度；并根据已知甲基化程度的标准曲线对未知样品的甲基化百分比进行测定。HRM 是一种高灵敏度的甲基化检测方法，并且其高度的重复性和低成本将对肿瘤的研究和临床应用有很大帮助。

6、法医学鉴定、亲子鉴定：检测单核苷酸多态性SNP 鉴定，插入/缺失多态性DIP 鉴定等应用举例：将HRM 用于法医学SNP、DIP 鉴定，协助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法，HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基因分子标记鉴定的方法。