vae1476
府宅
1. 胞浆蛋白的内参与胞核蛋白的内参是不一样的;
2. 在一定的实验条件下,内参蛋白的表达发生明显的变化时需要选择其他表达不变或者变化很小的蛋白;
3. 当研究的蛋白的分子量与内参接近时,需要选择分子量与目的蛋白的分子量差距比较大的蛋白。
bamboopiggy
内参一般用gaphd,actin,tubulin,histone H3,vinculin等,可以根据你目的蛋白的位置,插空用内参蛋白。
此外:
1.研究结肠癌的发生及转移时,细胞骨架蛋白 Vinculin 不适合做全细胞的内参。
2.尽管 HSP70 和 HSP90 正常情况下是组成性表达的分子伴侣,能够保持蛋白合成稳态,但环境压力下,HSP70 和 HSP90 不适合胞浆蛋白的内参。
3.当细胞发生凋亡的时候,核多聚 (ADP-核糖) 聚合酶 PARP 和核膜的结构组分 Lamins,都不适合做核蛋白的内参。在凋亡细胞体内,PARP 是 caspase-3 裂解的主要靶蛋白之一。
Lamin A/C 能够被 caspase-6 切割,可以作为 caspase-6 激活的标志。在凋亡过程中,Lamin A/C 能够被特异地剪切成大片段 (41-50 kDa) 和小片段 (28 kDa)。Lamin 的剪切会引起细胞核的失调和细胞死亡。
4.Actin ,一种广泛表达的真核蛋白,是细胞骨架的重要组分。研究证明在原始乳腺癌细胞中 Actin 是高度磷酸化的。研究也发现凋亡条件下,心脏肌肉以及骨骼肌中都能观察到 beta-Actin 的清除,因此,beta-Actin 不适用于心脏和骨骼肌的样品。心肌和骨骼肌样本可以用 alpha-Actin 做内参。
Caspase-3 对 Actin 的清除会加速泛素/蛋白酶体依赖的肌肉蛋白酶解。 细胞生长条件的改变以及与胞外基质组分的相互作用都可能会导致 Actin 蛋白合成的变化 。
5.GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶), 在糖酵解过程中将 3-磷酸甘油醛进一步磷酸化。虽然在不同组织中的表达水平有差异,但 GAPDH 普遍被认为是一个组成型表达的持家蛋白。正是由于这个原因,GAPDH 的 mRNA 和蛋白通常在对其它有变化的靶蛋白测定实验时作为对照。当代谢信号通路受到影响时 GAPDH 不适合做内参等。
6.球形微管蛋白亚基包含微管建筑块,由 α/β-tubulin 异源二聚体形成所有真核细胞的 tubulin 亚单位。 对抗微生物和抗有丝分裂药物耐受性的不同而会导致 Tubulin 的表达发生变化 。
以上的此外,是我忘记从那个帖子里面粘下来的 了,当时觉得有用,就留存了。
whilt-shirt
首先看你做的什么组织或细胞,内参一般选用在你实验中不会有影响的蛋白,另外考虑分子量要能够与目的蛋白区分开
bqejjh123
WB实验的非常重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中,靶蛋白表达量的相对多少。但是要衡量蛋白表达水平,前提条件就是等量的上样量。由于内参蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定,因此可以借助检测每个样品中内参的量来判断上样量是否均等,从而进一步判断结果是否可信。
其次内参蛋白的选择应遵循的原则:
(1)稳定表达:相对于总蛋白而言,内参蛋白的表达水平保持恒定
(2)分子量的大小:内参蛋白与目的蛋白的分子量大小最好相差5Kd以上。
(3)表达水平:在实验样本中内参蛋白应该是高表达的。
(4)丰度相似性:样本中内参蛋白的表达丰度应该与目的蛋白的丰度有相似性,不会出现信号饱和的现象,导致无法正确的判断出内参蛋白和目的蛋白的表达水平变化。
(5)根据实验样本的种属来源做选择。哺乳动物的组织或者细胞样本,可选择GAPDH、beta-Actin或alpha-Tubulin、Lamin B、PCNA、ATPase Na+/ K+ beta 2 (ATPB2);植物样本可选择plant actin、Rubisco。