如何取微小组织进行WB？

可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。

1.提取细胞蛋白2.BCA定量3.制备蛋白胶(SＤS-PAGE胶)4.蛋白样品变性5.电泳6.转膜7.封闭8.一抗9.ＴBＳT洗涤10.二抗11.TBST洗涤12.显影13.结果分析

准备：制冰，和胶同等大小的PVDF膜一张（用甲醇侵泡10s，

10min?），滤纸6张（也可以用2张？），将滤纸、夹子、海绵垫（2张）、玻棒浸放于加有转移液的搪瓷盘里。切膜和滤纸时需佩戴手套。

2.将夹子打开，使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻

棒来回擀几遍以排除气泡。将胶从玻璃板中剥下来，按海绵-2层滤纸-凝胶- PVDF膜-2层滤纸-海绵的顺序（每对齐覆盖一层，均需固定好位置排除气泡一次），合起架子并固定。

3.将“三明治”放入转移液槽中，使夹子黑面对黑面，白面对红面，

盖好盖子，接通电源，100V 2h，放入冰水浴中转移。

4.拆下转移装置，用TBS从下向上浸湿转移好的膜，移至含有封闭

液的平皿中（加盖防止水汽蒸发），室温摇床上封闭1h（2h或者4度过夜？）。

注：封闭液：2.5g奶粉+50mlTBST，混匀，现用现配。

5．洗膜：TBST溶液漂洗膜3次，10min/次（就是把TBST放平皿里，然后把膜浸泡在其中，摇床摇十分钟）。-有说封闭后不用洗膜

6.孵一抗：将一抗用TBST稀释至适当浓度，1:1000,10ul一抗+10ml 稀释液（稀释液：2.5g脱脂奶粉/BSA+50mlTBST）,将膜放入倒入一抗的表面皿或者培养皿，室温孵育膜2h。

注：稀释的一抗里可以加入0.002g的0.02%叠氮化钠，可在4度长期保存，可是供货商建议仍然-20保存？

7.TBST洗膜3次，10min/次。

必须进行研磨、匀浆处理，最好做超声处理，使蛋白质溶解度会更好，离心要充分。组织中的蛋白酶活性更强，需要加入抑制蛋白酶活性的抑制剂，防止蛋白降解。

可以用液氮速冻后，再用研钵研磨。

用干净的剪刀切取组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。